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  戒565 2016-03-13 00:00:00

  贴壁培养细胞 1) 倒出培养液，用1×PBS 清洗一次。 2) 按每10 cm2 生长细胞加2 mL TRIzol，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于细胞表面并裂解细胞，用移液枪吹打细胞使其脱落（对于贴壁牢固的细胞用细胞刮刮离表面）。 3) 将裂解液及细胞转移至一离心管中，用一次性注射器反复抽打直至裂解液清澈透明不粘稠。 4) 在15~30℃放置5 min1) 向裂解液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管（溶液充分乳化，成乳白状，无分相现象），在15~30℃放置3 min（由于氯仿沸点低、易挥发，振荡时离心管可能爆开，小心）。 2) 于4℃，12000 g，离心15 min（加速度：减速度=9:1）。 3) 从离心机中小心地取出离心管，吸取体积约为TRIzol 试剂起始加入量一半的上清至另一无RNA 酶的离心管（切忌吸动白色中间相）。 4) 向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15~30℃放置10 min（如果没有明显沉淀，可以-20 度过夜）。 5) 于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）。 1) 小心弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇1mL（切勿触及沉淀），轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小 心弃去乙醇。 2) 再加入75%乙醇1 mL，在涡旋器上短暂涡旋（使沉淀悬浮于75%乙醇水中）；于4℃，8000 g 离心 10 min。 3) 小心弃上清，短暂离心，用枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5 min 使乙醇挥发。 4) 加入适量的RNase-free Milli-Q，用枪吸取Milli-Q 水轻轻吹打沉淀，使其悬浮于Milli-Q 水中，50℃保温10 min，待RNA 沉淀完全溶解后，-80℃保存。 5) 一般来说，总RNA 沉淀应该快速地溶于Milli-Q 水中（正常的现象是，沉淀在Milli-Q 水中快速旋转并且同时溶解）。但是，某些RNA 沉淀，可能在悬浮于Milli-Q 水10 min 后仍有固体物存在，则于4℃，12000 g，离心10 min（加速度：减速度=9:1）后，转移上清至另一1.5 mL 离心管-80℃保存。剩余的固体物加入Milli-Q 水后也保存于-80℃。 6) 一般说来，用TRIzol 提取到的总RNA 中盐含量是比较高的，因此沉淀的洗涤非常重要。上清和管壁上残留的液体要尽量除去干净。

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