流式细胞术的实验方法
流式细胞仪（Flow cytometer ）是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。下面就让小编带你了解一下流式细胞仪具体的实验操作。
PI染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、加入PBS1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNaseA(工作浓度20ug/ml)于500ul1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml)于500ul1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中，4℃冰箱保存，待测。
GFPPI染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、加入PBS1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNaseA(工作浓度20ug/ml)于500ul1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml)于500ul1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中，4℃冰箱保存，待测。
细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS 1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、用PBA稀释的diyi抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清。
4、PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
5、PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
6、PBS 1ml离心洗涤2次。
7、将细胞重新悬浮于500ulPBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。
胞内直接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
3、4%PFA 1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
5、0、1%Triton-1001ml,室温10min。
6、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
7、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul，用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8、离心弃上清液。
9、加入冷PBS 1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
10、向细胞中加入冷PBS500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
胞内间接免疫荧光染色操作步骤
1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm,5min，弃上清液。
2、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
3、4%PFA1ml，4℃固定30min。
4、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
5、0.1%Triton-1001ml,室温10min。
6、用1×PBS1ml洗涤1次，离心。
7、加入用PBA稀释的diyi抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1.5-2h。离心，弃上清。
8、冷PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
9、加入PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。
10、冷PBA 1ml离心洗涤2次。
11、将细胞重新悬浮于500ul PBS中，混匀，置流式管中，避光，4℃冰箱保存，待测。
注：
1、RNaseA：贮液浓度：1mg/ml；
工作液配制：加1mg/ml贮液10ul于500ul×PBS中，使终浓度为20ug/ml。
2、PI：贮液浓度：2.5mg/ml
工作液配制：加2.5mg/ml贮液10ul于500ul×PBS中，使终浓度为50ug/ml。
3、PBA：即PBS加1-2%牛血清白蛋白，加0.1%叠氮钠。
4、检测样品细胞浓度1x10的六次方/ml。
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