膜片钳实验方法
1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术(patch clamp recording technique)。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术(gene cloning)并架齐驱,给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
一、微电极的制备
用拉制器拉制玻璃毛细管形成微电极。封接电阻和记录时的噪音大小完全取决于玻璃微电极的选材和拉制质量。
1.选材
依据不同的记录模式选用不同的玻璃毛细管拉制膜片钳实验所用微电极,玻璃毛细管可分为两类,分别为硬质玻璃和软质玻璃。
2.拉制
膜片钳实验时,用来进行细胞外记录的微电极和细胞外记录所用的微电极不相同,它的锥度较大,较短,的直径是1-5μm,在充灌格氏液的时候阻抗大概是1-5ΩM。所以,通常采用两步拉制的方法。首先将玻璃软化,拉出一个杆,长度是7-10mm,直径是200-400μm。Z后再用较小的电流从杆中间拉出2根锥度较大的微电极。
3.处理
在成功拉制微电极以后,需要进一步处理它的。处理的过程包括涂硅酮树脂和热抛光。
涂硅酮树脂是指在微电极以外的地方涂上硅酮树脂,从而让浸入溶液的微电极表面呈疏水性以便使电极内部和溶液之间的电容变小。
热抛光指的是在显微镜下,把微电极部分靠近热源,使得电极表面更加光滑和宽阔,以便经过热抛光后的微电极能够显著地提高高阻封接的成功率。
4.充灌
在使用微电极之前,需要充灌电极内液,要用0.2μm的滤膜进行过滤。充灌的时候,首先要在电极内液中浸入电极,在部分充满液体后,再从电极尾部进行充灌,如果电极里有气泡,需要将电极向下,轻敲管壁去除气泡。电极内液也不能充灌太多。
二、细胞标本的制备
除了脑片膜片钳以及盲膜片钳法以外,实验需要色细胞标本都是具有生物活性的离体细胞。在细胞标本的制备中,因为不同组织细胞之间连接的牢固程度不一样,所以需要采用不同的分离方法。制备步骤大体上包括冲洗,酶解消化或机械分离和清洗。
三、高阻封接的形成
记录细胞离子通道电流能否成功取决于高阻接是否形成。在细胞膜和微电极形成封接的过程中,可以用吃机器发出1mV的脉冲电压在微电极上作用,使得膜两边电位差变化,从而产生电极电流,而后通过电极电流幅度的变化来确定封接程度。
四、离子单通道电流的记录或全细胞记录
单通道记录
膜片钳记录的Zda的优势就是对单通道电流的记录。当细胞膜和微电极形成高阻接后,能够轻易地通过单通道电流的特征从而得到对某种离子有选择通透性的离子通道电流。
全细胞记录
膜片钳的基本模式之一就是全细胞记录,虽然它记录的是细胞多个离子通道开放产生的宏膜电流,但是,它不仅能够宏观地分析离子通道的性质和分类,还能够微观地分析离子通道的构造,分布和功能,因此,其在当前电生理研究中应用非常广泛。
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