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1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种根据记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。生命科学研究因为它和基因克隆技术，获得了巨大的前进动力。

膜片钳技术是以玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜利用负压吸引封接起来，因为电极与细胞膜的高阻封接，使得从电学上隔离了电极笼罩下的那片膜与膜的其他部分，所以这片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，以一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就得到单一离子通道电流。

膜片钳实验仪器主要包括放大器、微型操纵器、倒置显微镜、防震台、屏蔽笼、灌流槽以及数据采集和处理设备。和一般的电生理实验相比，放大器、微型操纵器和倒置显微镜是膜片钳实验必需的仪器。

膜片钳放大器

膜片钳技术Z核心的仪器当属于膜片钳放大器。差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿以及钳位放大器等共同组成了膜片钳放大器。其中差分放大器指的是电流-电压转换器，它能够将记录到的电流用电位差的方式输出。目前放大器以及经历三代的发展。

倒置显微镜

之所以需要倒置显微镜来放置标本，是由于膜片钳实验所需的标本大多数是急性分离的细胞或者培养的细胞。

微型操纵器

在膜片钳实验中，微型操纵器起着至关重要的作用。微型操纵器的好坏主要表现在稳定性方面。目前常用的微型操纵器包括机械微型操纵器、三维液压微型操纵器、压电微型操纵器。其中压电微型操纵器的稳定性Z好。

微电极

如果想要膜片钳实验封接成功的形成，那么首先要确保细胞表面干净，然后需要制备合格的微电极。微电极采用两步拉制工艺。充灌的时候，首先要在电极内液中浸入电极，在部分充满液体后，再从电极尾部进行充灌，需要避免电极有气泡。

与膜片钳的介绍相关文文章：
• 膜片钳技术的介绍和发展历史

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。

       在倒置显微镜下，让微电极渐渐靠近细胞，当微电极与细胞接触时，给微电极一个很小的负压，形成吉欧封接，然后再给微电极管里一个很小的负压，使得电极覆盖下的细胞膜破裂，从而使得电极液和细胞内液想通，而和浴池里的溶液绝缘，形成了全细胞模式。全细胞模式不是记录小片膜的离子电流，而是记录全细胞的离子电流。即使电极里的膜片被吸破，然而微电极和细胞封接的阻抗很高，这是保持全细胞记录的重要条件。

用药物或者毒素等非生理性成分更换掉电极内液，对电压依赖性通道因为药物而受到什么影响而进行研究。从而在通道开关动力学，对药物作用的功能机制在微观水平上进行研究。还能够对内外液的浓度成分进行任意的改变，来对各组分对膜通透性的影响进行研究，尤其是氢离子和钙离子的浓度要适当。也可以在膜受体相应地使用激动剂，在对离子通道电流流动的监测过程中，对经G蛋白介导的第二信使作用进行了解，对跨膜信息转导进行研究。

全细胞模式中，电极内液和细胞内液扩散混合不仅会使得细胞内液的成分发生变化从而导致细胞的电变化受到影响，而且还经常让全细胞记录发生run down 现象。为了防止此情况的发生，需要用穿孔膜片钳法（perforated patch），就是在微电极中充灌制霉菌素（nystatin）和二性霉素（amphptericns）,和细胞膜中的类固醇产生反应后，生成了较大颗粒不能够通过但是一价离子允许通过的小孔，这些小孔导电，对所记录的电流不会产生影响，和二性霉素相比，制霉菌素有更加好的效果。

与膜片钳的工作原理相关文文章：
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• 膜片钳的技术原理

膜片钳技术是通过微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，用千兆欧姆以上的阻抗使之封接，在电学上分隔和电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）以及其周围，在此基础上固定点位，对这膜片上的离子通道的离子电流（pA级）进行监测记录的方法。下面就让小编为你介绍一下膜片钳技术的科学研究应用。

目前，膜片钳技术在神经科学，心血管科学，运动生理等多学科领域的研究得到了非常广泛的应用。在通道记录中，能够分别在不同位置，不同时间施加各种浓度的药物或者毒素，用来对它们给通道功能带来的可能影响进行研究。是膜片钳技术的显著的优点。

电压门控性离子通道的动力学特性研究

各种离子通道功能的精确调节和数量的平衡表达使得细胞能够维持正常的功能。激活门和失活门是离子通道的两个门。这就表明离子通道有三种状态，分别是激活，关闭和失活三种状态。对电压门控性离子通道的功能特点的揭示取决于对离子通道三种状态的动力学过程的研究。一些疾病或者一些临床药物之所以发挥作用，就是因为通过对上述离子通道三种状态的动力学过程的影响。

细胞特性的研究

细胞的基本特性包括细胞的被动膜特性和细胞的主动膜特性。细胞的被动膜特性有膜时间常数、膜电容、膜电阻、膜静息电位等。可兴奋细胞还包含如动作电位的形式、阈值、幅度、频率等的细胞的主动膜特性。细胞的成熟程度通常是由这些指标反映的。细胞的发育不同，这些指标也会跟着不同。

离子通道的鉴别

细胞表达的离子通道的定性和定量能够采用膜片钳技术进行分析，这替明确某些细胞的电生理特性打下了基础。

突触联系可塑、学习记忆和其机制的研究

评价学习记忆和其突触可塑的常用的电生理指标是长时程增强（LTP）。目前海马脑片离体实验已经在学习记忆方面的研究得到广泛的应用。为了能够在细胞水平研究学习记忆的机制，需要利用膜片钳技术记录脑片LTP。

突触传递，突触联系研究

神经元之间能否形成突触联系的特异性电生理指标，就是突触后的电流。修复损伤的神经系统的新的ZL手段是神经干细胞移植。移植的干细胞只有和其他正常的神经元发生功能性的联系，它才能够发挥ZL作用。

与膜片钳的应用相关文文章：
• 膜片钳与其他技术的结合使用以及实验中的常用术语
• 膜片钳实验方法
• 膜片钳离子通道研究历史

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。

传统膜片钳技术优点：

1.对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率，信息含量大。

2.灵活性好，既可以改变细胞膜电位，又能够控制改变细胞内外溶液的成分。

3.应用广泛：能够分析检测一切离子通道类型。

4.可以记录到pA级电流的变化以及单通道开关状态，所以具有非常高的灵敏性。

5.与荧光标记与反射性标记等手段相比具有更加高的精确性和权威性。

传统膜片钳技术缺点：

1.仅可以对单通道进行操作，通量低，不能够对细胞之间的通信与细胞网络进行研究，难以方便的换取细胞內液。

2.在检测的过程中，因为通道表达少而导致丢失数据点造成数据不准确，需要大量的进行实验。

3.要求操作者需要极高的实验数据。

全自动膜片钳技术优点：

1.全自动膜片钳技术效率非常高，是传统膜片钳技术效率的20-300倍。

2.自动化，可以节省实验人员的很多时间和精力。如寻找细胞，形成封接，破膜等整个实验操作全都实现自动化。

3.不再需要传统膜片钳技术所需的显微镜，微操纵器，微电极拉制仪，屏蔽网，灌流、浴漕等等。

4.人为操作的误差少，获得的数据准确性高。

5.对于药物的加样设计表现优异。

全自动膜片钳技术缺点：

1.只能在悬浮细胞实验时使用。

2。仅能对全细胞模式、穿孔膜片钳模式、细胞贴附式单通道模式进行记录，而不可以对其他模式进行记录。

3.和手动膜片钳相比，仪器及耗材价格更贵。

与膜片钳的特点相关文文章：

工作原理

工作原理膜片钳是一种能够直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。它的基本原理是以一个光洁，直径约为0.5~3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触，之后对微电极另一端开口处施加适当的负压用电极的纤细开口将与电极接触的那一小片膜轻度吸入，如此在微电极开口处的玻璃边沿以及这一小片膜周边会形成紧密的封接，它的电阻能够达到数个或数十个千兆欧，这世界上就是在化学上完全隔离了吸附在微电极开口处的那一片膜同膜的其余部分，通过微电极记录到的电流变化仅仅和该膜片中通道分子的功能状态相关联。若在这一小片膜中仅仅有一个或少数几个通道蛋白分子，那么通过微电极测量出的电流，就是某种带电离子经由开放的单一通道蛋白质分子进行跨膜移动的结果。

操作步骤：

1.打开总电源。

2.依次打开电脑、显微镜、监视器、微操、放大器。

3.打开PULSE软件，在E盘建立自己的文件夹。

4.灌注玻璃电极并排空气体。

5.装上玻璃电极，浸入液面并调至视野范围。

6.点击set-up，将增益调为0.5，点Auto，记录电极电阻。

7.封接细胞，若上G，提起或吸破细胞。

8.依次点击on-cell，whole-cell补偿。

9.选定In-out或whole-cell模式进行实验。

10.用完关闭仪器，并切断总电源。

注意事项：

1.为了防止尘埃、静电伤害机器，每天做实验前请用清水拖地。

2.拉制仪使用前需预热15-30min。

3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换次氯酸钠。

4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。

5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时才可关闭。

6.在放大器打开时不能用手、金属物品或其它导电的物品接触电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。

7.向玻璃微电极灌注内液时切勿灌太多（1cm左右为适），以防液体进入银丝底部增加噪声。

8.安装玻璃微电极时，电极应与银丝平行，防止刮蹭银丝电极。

9.玻璃微电极需先用甲醇浸泡，再用酒精灯微烧两端，使其平滑。

10.换液时应时刻观察浴槽，防止液面过低或液体溢出污染镜头，Z适液面为微高于出液口。

11.浴槽及灌流系统用毕请及时清洗，防止长菌影响实验。

12.打雷天气必须禁止膜片钳实验。

13.干燥季节请先用手触摸金属框架释放身体的静电。

14.每位实验者请在E盘建立自己的文件夹储存数据。

15.实验者可以根据需求设定自己的电极拉制和patch模式参数，但请大家不要随意修改软件、显微镜以及拉制仪的默认设置。

与膜片钳的使用注意事项相关文文章：

1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术（patch clamp recording technique）。这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。它和基因克隆技术（gene cloning）并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。

膜片钳技术因为全自动膜片钳技术的出现已经进入了一个全新的阶段。传统膜片钳技术一次只能记录一个细胞，对于实验人员来说，不仅会耗费大量的时间，而且耗费相当大的精力。传统膜片钳技术不适合记录大量细胞的基础实验研究，也不适合在药物开发初期和中期的大量筛选化合物。全自动膜片钳技术通量高，一次能记录几十甚至几百的细胞，而且能够自动化找细胞，形成封接，破膜等的实验过程。大大提高了实验人员的效率。全自动膜片钳技术技术不同，采用的原理也不相同。

1.Population Patch Clamp技术

Population Patch Clamp技术不再采用玻璃电极，而是采用PatchPlate平面电极芯片。这个芯片包括很多小室，有很多1-2微米的封接孔在每一个小室内。当记录的时候，每个小室内封接成功的细胞数量很多，这些细胞通道电流的平均值就是获得的记录。所以，不同小室通道电流的变异系数很小，一致性非常好。

2.Flip-TIp翻转技术

Flip-TIp翻转技术是向玻璃电极中灌入一定密度的细胞悬液，在电极外施加一定的负压使得在电极的单细胞和玻璃电极之间形成稳定的高阻封接，使露在玻璃电极开口处的细胞膜破裂就形成全细胞记录模式。这种技术的显著特点是药物施加微量快速，仍然使用玻璃作电极。

3.SealChip技术

和Population Patch Clamp相同，SealChip技术完全不采用玻璃作为电极，而是采用SealChip平面电极芯片，往芯片上面灌入一定密度的细胞悬液，随机下降到芯片1-2微米的孔上并通过自动的负压形成稳定的高阻封接，使得孔下面的细胞膜破裂形成全细胞模式。

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