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反义寡核苷酸(ASOs)是一类通过序列特异地与靶基因DNA或mRNA结合而抑 制该基因表达，从而在基因水平进行调控的分子药物。

图1.反义索核苷酸作用原理。

由于以下诸多因素，寡核苷酸难以进行LC-MS分析：

• 需要离子对试剂或非反相色谱；

• 需要小心地进行前处理和样品制备；

• 经常受色谱系统中的消耗品和管路金属表面相互作用的非特异性结合问题。

沃特世新推出的高性能Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪与Waters ACQUITY Premier系统联用很好地解决了上述问题。今天，就让我们一起看看这套系统在反义寡核苷酸分析中展现出来的非凡性能吧！

图2. Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱系统

实验分析

样品准备

• 标准品: 

  沃特世MassPREP寡核苷酸分离技术(OST)标准品（部件号：186004135）和寡脱氧核苷酸硫代磷酸酯GEM91 (Trecovirsen)用TE缓冲液分别配制成10 μm和1 mg/mL。

• 基质加标样品：

  用血浆对储备液进行倍比稀释。

• 样品前处理：
  血浆样品用苯酚：氯仿：异戊醇 25:24:1进行液-液萃取法萃取用，然后用+99%的氯仿二次萃取。最 后，将所有水提取物干燥并在100 μM EDTA溶液中复溶。

LC-MS/MS方法

• 液相条件：

流动相A:100mm HFIP六氟异丙醇+15mm DIPEA N, N-二异丙基乙基胺水溶液；
流动相B:100mm HFIP六氟异丙醇+15mm DIPEAN, N-二异丙基乙基胺,80%乙腈；
色谱柱: ACQUITY Premier Oligonucleotide C18色谱柱, 130Å, 1.7 µm, 2.1x50 mm(p/n:186009484)。

• 梯度条件：

质谱条件 (ESI -):

表1. MRM通道信息。

结果与讨论

灵敏度：

使用高性能Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪与Waters ACQUITY Premier系统联用对ASOs进行分析时，LLOQ低至0.1 ng/mL。下图是GEM91(m/z 597.2>319.1)、在LLOQ浓度的色谱图，可以看到ASOs在低至0.1 ng/mL下仍表现出较高的灵敏度和良好的信噪比。并且在0.1 ng/mL时，多个离子对均显示出较好的信噪比，即便碎片非常小，也获得了非常高的灵敏度。

图3. GEM91(m/z 597.2>319.1)LLOQ相对于基质背景的色谱图。

图4. 0.1 ng/mL GEM91不同离子对色谱图。

动态视线范围：

下图为两个ASO在0.1到10000ng/mL五个数量级的线性范围内的线性，可以看到两个曲线r2大于0.99，展现了TQ Absolute检测器非常好的线性范围。

图5. GalNac0.1到 10,000 ng/mL线性。

图6. GEM91 0.1到10,000 ng/mL线性。

准确度：

对基质加标工作曲线和QC样品进行了准确度测试，结果如下表：可以看出基质加标工作曲线各点和QC样品准确度在两个ASO不同的离子对通道都表现出非常好的结果，准确度在87到112之间。

表2. 准确度测试结果

结论

Xevo TQ Absolute能够为基于串联质谱(LC-MS/MS)的生物基质中寡核苷酸定量的常规液相色谱生成高质量数据。

对于反义寡核苷酸和寡核苷酸标准品，在人血浆中观察到0.1 ng/mL水平的灵敏度和良好的寡核苷酸动态线性范围性能。

在分离系统和分析柱中使用具有MaxPeak高性能表面(HPS)技术的ACQUITY Premier有助于减轻金属吸附，确保定量生物分析测定稳健和灵敏的定量性能。