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生物分析是药物发现和开发过程的关键组成部分，可提供有关新化学实体药代动力学和剂量反应的信息。由于更强 效的候选药物要求剂量更低，液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法的灵敏度变得日益重要。在满足这种更高灵敏度要求的同时，还需要在实验室之间无缝转移。因此，除MS灵敏度外，仪器间重现性也很重要。

Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪具有极高的灵敏度和出色的耐用性，在生物分析研究中能够发挥灵敏、可重现、稳定的性能。本篇应用使用Xevo TQ Absolute系统对大鼠血浆中的咪达唑 仑和丙咪嗪进行了定量分析。

图1. Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪

实验部分样品前处理

使⽤300 μL乙腈通过漩涡混合沉淀100 uL样品。在25000 g下离心后，将上清液用去离子水按1:1的比例稀释。取10 μL所得溶液注入UPLC-MS/MS系统。

液相色谱条件

• 液相色谱系统：ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统

• 样品瓶：1 mL 96孔板

• 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱, 130 Å, 1.7 μm，2.1 mm x 50 mm，1根/包

• 柱温：55 °C

• 样品温度：10 °C

• 进样体积：10 μL

• 流速：0.45 mL/min

• 流动相A：0.1%甲酸的水溶液（含10 mM甲酸铵）

• 流动相B：0.1%甲酸的乙腈溶液

梯度表：

质谱条件：

• 质谱系统：Xevo TQ Absolute

• 电离模式：ESI+

• 采集范围：MRM通道：

咪达唑 仑 ‒ 326.1>291.0 (CV=60, CE=26)

丙咪嗪 ‒ 281.1>86.0 (CV=30, CE=16)

• 毛细管电压：0.5 kV

• 数据管理软件：MassLynx v 4.2

结果与讨论

为评估方法的灵敏度和重现性，使用由ACQUITY UPLC I-Class和Xevo TQ Absolute组成的UPLC-MS/MS系统成功分析了校准曲线标样和QC样品。批次和进样顺序如下：校准曲线标样(0.2、0.4、1、5、10、50和100pg/mL)，前后使用空白血浆样品；随后是QC样品(0.2、0.4和1.0 pg/mL，n=4)，按浓度递增顺序进样，前后使用空白血浆样品。两种目标分析物在反相色谱系统上得到充分保留，并实现了基线分离。咪达唑 仑和丙咪嗪的保留时间分别为1.1和1.5分钟。两种分析物（咪达唑 仑和丙咪嗪）的校准曲线在整个浓度范围(0.2-100 pg/mL)内均呈线性，使用1/x加权得到的r2值高于0.99。两种分析物的检测限均为0.2 pg/mL。

图2. 空白基质和QC样品谱图。

计算两种分析物在0.2、0.4和1.0 pg/mL浓度下的精密度(%CV)，确定这两种分析物的定量限。所有QC⽔平的平均计算浓度均精确至两个分析标称值的15%以内。结果测得丙咪嗪和咪达唑 仑的定量下限(LLOQ)均为0.2 pg/mL，精密度均<11%。下图显示了在0.2、0.4和1.0 pg/mL浓度⽔平下观察到的丙咪嗪和咪达唑 仑的变异系数。

结论

本研究使用Xevo TQ Absolute串联四极杆质谱仪与ACQUITY UPLC I-Class PLUS联用系统展示了一种定量分析大鼠血浆中咪达唑 仑和丙咪嗪的高灵敏度UPLC-MS/MS生物分析方法。研究结果表明，该方法具有非常高的灵敏度（柱上进样量250 ag）和重现性（RSD%<11）。