解锁高阶模式，Oligo全面表征流程

来源：赛默飞色谱与质谱中国分类：商机 2022-06-15 10:36:27 300阅读次数

随着新冠类核酸疫苗的成功，核酸制药行业开始蓬勃发展（如mRNA和小核酸）。在今年的ASMS中，应广大客户要求，赛默飞推出mRNA和小核酸的深度解析workflow，提供一站式解决方案（图1）。该workflow涵盖前处理、色谱分离、质谱表征、数据处理和报告输出等内容，不仅帮助客户全面、深度地解析核酸产品、指导工艺优化，还为核酸产品从研发到生产的转换提供解决方案。

图1. 核酸深度解析workflow

整体特点与优势

★样品前处理——完整的核酸酶体系：

包含H酶和T1酶等。其中，磁珠结合的T1酶，实现了核酸mapping分析的高覆盖度和良好重复性；

★色谱分离——DNApac™ RP色谱柱：

为核酸的加帽、加尾和mapping分析提供良好的峰形和重复性；

★色谱分离——Vanquish™系列UHPLC：

生物兼容系统，极大减少金属加合峰，提高目标组分的质谱响应；

★数据采集——Orbitrap系列质谱检测器：

质量轴最稳定、灵敏度和分辨率最高的Orbitrap质谱，用最全面、清晰、可靠的数据为您呈现核酸产品本来的样子；

★数据分析——BioPharma Finder软件（以下简称BPF软件）：

精确到碱基的序列和修饰设置、灵活的酶切位置选择、完善的加合峰设置，让每一种可能尽在掌握。BPF 5.1升级去卷积方法，完美实现硫代核酸的分子量解析。在核酸mapping分析中，BPF 5.1利用先进的动力学模型算法和随机序列生成器，为核酸序列鉴定结果提供多重卡值，确保鉴定结果的可靠性。

mRNA的 mapping分析

Mapping分析时为了获得特异性较强的长核酸片段，通常采用人为漏切的方法，但该操作也为Mapping分析带来诸多挑战（图2）。

图2. Mapping分析的挑战与赛默飞解决方案

赛默飞核酸分析workflow（图3）完美解决mapping分析遇到的难题，实现核酸单个碱基鉴定和序列高度覆盖分析（图4），相关成果已发表在《Analytical Chemistry》(Vanhinsbergh et al, Analytical Chemistry, 2022, 94, 20, 7339–7349 ）。

图3. BPF软件mapping解析界面(上)和赛默飞mapping分析workflow（下）

图4. 长达48 mer的核酸序列多价态（17、19、20）均可实现鉴定

为了实现核酸序列的准确鉴定，除了优质的一级和二级数据以外，软件的解析也必不可少。BPF5.1采用先进的动力学模型算法，预测二级碎片m/z的同时还预测二级碎片的强度，综合同位素峰形、二级碎片强度和质量偏差等因素得到的confidence卡值可减少核酸鉴定的假阳性（图5）。此外，BPF5.1还创新性地将随机序列生成器用于核酸序列鉴定卡值，进一步确保核酸鉴定的可靠性。

图5. 传统的核酸二级预测图（上）、BPF核酸二级预测图（中）、核酸二级实测图（下）

mRNA 加帽

Orbitrap的高灵敏度、高分辨率和高稳定性，以及BPF软件灵活的序列设置，为全面解析加帽产品、准确计算加帽率保驾护航（图6）。

图6. mRNA加帽检测关键点

mRNA加尾检测

Orbitrap的高分辨率为polyA的检测提供准确分子量，即使是分子量超过4万的polyA偏差仍小于1 Da。同时，Orbitrap的高灵敏度可实现低丰度polyA组分的检测，还原一个真实的polyA分布图（图7）。

图7. mRNA加尾检测

小核酸检测

小核酸的检测通常包含分子量、序列（同mRNA mapping的鉴定需求）、杂质（同mRNA mapping的鉴定需求）、临床分析和代谢分析。其中，普通去卷积方法无法为一些修饰的小核酸，如硫代小核酸获得准确的分子量。BPF5.1 软件利用硫同位素的独特丰度分布，生成序列特异性的同位素模型，从而更为便捷地获取精确解卷积结果（图8）。