单细胞单颗粒 | 利用SC-ICP-MS评估卵巢癌细胞对顺铂的摄入
在西方国家,顺铂,卡铂和奥沙利铂是使用最广泛的铂类癌症化疗药物。卡铂的有效性是由于其可以与DNA结合从而导致DNA-铂(Pt)加合物的形成,但这也会造成DNA的弯曲。因此在化疗后细胞必须修复DNA损伤,否则DNA复制受阻会导致细胞死亡。许多癌症患者最初对基于铂类的治 疗比较敏感,但一段时间后,患者通常对顺铂治 疗表现出耐药性,导致了癌症的复发。顺铂耐药性归因于三种主要的分子机制:DNA修复的加速,胞浆失活的加速和细胞摄取药物能力的变化。其中,细胞摄取药物能力的变化主要表现在细胞对顺铂的摄入能力降低或者顺铂转运的加速。
细胞内顺铂的摄入与肿瘤负荷相关,也就是说肿瘤对顺铂反应降低会导致细胞内顺铂的含量降低。所以,分析单个细胞水平对顺铂的摄入和分布对于评估治 疗的有效性具有非常重要的意义。过多顺铂进入细胞内会增加DNA损伤和细胞死亡的频率。了解细胞对顺铂的摄入将能为新疗法的开发提供参考,以提高肿瘤对顺铂的敏感性。
如图1所示,研究顺铂摄入的首要问题是设计出合适的分析方法。传统方法是,将细胞群置于顺铂培养液中,然后测定细胞群内铂的总量:先将细胞消解,然后通过原子吸收光谱(AAS)或者电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等技术检测铂的浓度。然而,浓度的意义并不明确,从而导致了一些问题:
1、在细胞水平上,这个浓度的含义是什么?
2、是否所有细胞都具有同样的细胞内顺铂浓度?
3、是否一些细胞具有高浓度的顺铂而另一些只有低浓度或者没有顺铂?
图1. 细胞群顺铂摄入的各种可能性
传统方法的缺陷在于铂的浓度只反映整体细胞群内的浓度而不是个体细胞内的浓度。因此,顺铂摄入在个体细胞之间的分布和差异无法通过传统方法体现。实际上,细胞对顺铂的摄入最有可能根据个体有很大差异,但至今还没有有效的方法来评估。
本文介绍了一种全新的技术,可对金属在单一细胞水平上进行定量:单细胞电感耦合等离子体质谱 (SC-ICP-MS)。SC-ICP-MS是以单颗粒电感耦合等离子体质谱(SP-ICP-MS)技术为基础,后者能够在溶液中对纳米粒子进行评估与定量。两种技术都基于测量单个细胞(或单个纳米颗粒)在进入等离子体时产生的离散信号的原理。每个细胞中的金属成分离子化,产生离子流,检测器以每秒100000数据点的速度快速对信号采集测量,从而使得单个细胞中的金属含量能被定量到阿克(ag)/ 每细胞的水平。相比测量细胞内顺铂摄入的传统方法,SC-ICP-MS 所得结果的信息量更加全面。本文介绍了利用SC-ICP-MS来研究单个细胞水平下的顺铂的摄入行为。
细胞的培养和顺铂处理
所有实验使用卵巢癌细胞为A2780和A2780/CP70细胞系。细胞生长温度为37℃,CO2浓度低于5%,使用RPMI 1641培养基(Gibco™),含有10%胎牛血清(FBS,Gibco™),胰岛素(Sigma-Aldrich™),L-谷氨酰胺(Gibco™)和青霉素-链霉素(Gibco™)。在血清饥饿试验中,细胞铺板并允许附着。大约18小时培养后移除培养基并以无血清培养基更换,之后再更换成普通培养基,并开始用顺铂处理。在加入培养基前,顺铂被分散在1mg/mL的无菌盐溶液中并用力摇匀30分钟。图2显示了样品预处理的流程图。
图2. 样品前处理步骤示意图
分析使用珀金埃尔默公司的NexION® 电感耦合等离子体质谱(ICP-MS),结合Syngistix™单细胞应用软件模块进行数据采集和处理。
NexION® 系列电感耦合等离子体质谱仪
NexION® 系列电感耦合等离子体质谱仪采用业内首 创多重四极杆ICP-MS。独有的四组四极杆设计结合碰撞反应池技术,提供超低的背景等效浓度和优异的检测极限,获得分析结果的高精度和可重现性,性能全面优于现有高分辨HR-ICP-MS、传统三重四极杆和单四极杆ICP-MS。通过各四极杆的不同质量分辨能力和工作模式,结合碰撞反应池技术,实现化学高分辨,获得终 极干扰消除。
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