解决方案 | 清洁验证中总有机碳的测定

来源：浙江泰林生物技术股份有限公司分类：商机 2023-03-23 11:17:44 1264阅读次数

药品生产每道工序完成后，对制药设备进行清洗是防止药品污染和交叉污染的必要手段，清洁验证的目的就是通过实验结果表明所指定的清洗规程能使设备的清洗效果达到洁净要求。清洁验证的前提是需要有合适的方法对目标化合物进行检验，即分析方法验证。

根据产品清洁的难易程度及综合溶解度和浓度检测，发现盐酸林可霉素是最难清洁的残留药物。按照清洁验证分别采用MTDD法、10 ppm法和LD50法进行计算，选择最低残留浓度为≤1.72μg/mL，在此残留浓度下我们通过HPLC方法测试，无法满足方法学验证要求，通过对总有机碳（TOC）法测定林可霉素残留物的分析方法验证开发，以保证数据的准确性。

PART.1
预验证内容和方法
1仪器基本性能确认---系统适用性实验

使用蔗糖标准品配制成质量浓度为0.5 mg/L 的蔗糖标准品溶液，作为易氧化的有机物，并测定其响应值（Rs）。使用1,4-对苯醌标准品配制成质量浓度为0.5 mg/L 的1,4-对苯醌标准溶液，作为系统适用性难氧化的有机化合物，并测定其响应值（Rss）。同时测定用于配制两瓶标准溶液的空白试剂注射用水的响应值（Rw）。当响应效率R=(Rss－Rw)/(Rs－ Rw)×100%达到85%～ 115%，则符合要求。

2盐酸林可霉素的校准曲线

根据《药品生产验证指南》采用10 ppm 法，以日治疗量的1/1000及基于毒性半数致死量确认最低残留检测限度为1.72 μg/mL，用盐酸林可霉素标准品（以C18H37N5O9计）配制成一系列不同浓度的标准溶液，用总有机碳（TOC）测试仪检测不同浓度溶液所对应的TOC响应值，将所测得的TOC响应值和盐酸林可霉素浓度关系式建立TOC测定值与盐酸林可霉素含量之间的线性关系。

3擦拭回收率

精密称取林可霉素标准品，用注射用水配制成质量浓度为86μg/mL的盐酸林可霉素溶液。精密量取上述溶液1.0mL，均匀涂布在划有多个与设备表面材质相同的10cm×10cm 不锈钢板上，于40℃恒温干燥箱中烘干6h后取出，冷却。用润湿的棉签用力且平稳缓慢地逐一擦拭不锈钢板表面，在向前移动的同时将其从一边移到另一边并覆盖整个表面，翻转棉签头，将棉签头的另一面在不锈钢板表面上与前次方向垂直擦拭整个表面。擦拭完毕后将棉签头折断至盛有50mL溶剂的样品瓶中，摇匀，作为供试品溶液。

4准确度

分别精密量取上述86μg/mL的林可霉素溶液1.0 mL，置于50 mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。按照TOC测试仪操作规程，测试标准溶液样品的TOC值。

5精确度

精密量取上述86μg/mL的盐酸林可霉素溶液5mL置于250 mL量瓶中，用注射用水稀释至刻度，摇匀。按照TOC测试仪操作规程，连续测试理论浓度为1.72 μg/mL的标准溶液样品6次，记录TOC值。

PART.2
仪器及试剂
01泰林分析 HTY-GM2000型总有机碳分析仪

纯水：电导率<1.0µS/cm，TOC浓度不超过0.5 mg/L的水；

02标准溶液配置
蔗糖标准原液（125mg/L）

将蔗糖对照品于105℃干燥至恒重，至于干燥器中冷却后，精密称取0.1489g,用检查用水溶解后移至500ml容量瓶中，用检查用水稀释至刻度，摇匀。配置成碳浓度125mg/L蔗糖标准液原液。

1，4-对苯醌标准原液（125mg/L）

用烧杯盛取500mL总有机碳检查用水，至于恒温箱中加热值70℃，精量称定1,4-对苯醌0.0947g，置于250mL的烧杯中，加入200mL 70℃总有机碳检查用水，溶解后移至500mL容量瓶中定容，摇匀，作为125mL/L的标准原液。

盐酸林可霉素标准品母液

用注射用水配制盐酸林可霉素标准品母液的质量浓度为100 μg/mL，然后稀释成系列供试液。

PART.3
实验过程及结果数据
1系统适用性结果

RSS(mg/L)	RS(mg/L)	RW(mg/L)	响应效率R/%	是否合格
0.531	0.537	0.034	98.9	合格

2盐酸林可霉素的校准曲线

采用TOC法测定不同浓度下的盐酸林可霉素溶液总有机碳值，将林可霉素溶液浓度为横坐标，总有机碳值为纵坐标作线性图。

实验次数	浓度μg/mL	TOCμg/mL
1	1.5	0.582
2	1.2	0.478
3	0.75	0.322
4	0.3	0.172
5	0	0.046

校准曲线为：y= 0.3527x + 0.0554 R² = 0.9989

检测限：LOD=3.3 SD/B=3.3* (0.0554/0.3527) = 0.518 μg/mL ；

定量限：LOQ=10 SD/B =10*(0.0554/0.3527) = 1.57 μg/mL（SD为校正曲线的截距作为标准差；B为校正曲线的斜率）。

通过计算得出检测限和定量限分别为0.518和1.57μg/mL，表明这两者均低于盐酸林可霉素注射液实际残留检测限度1.72μg/mL。

3擦拭回收率

空白试剂：y=0时。X=1.057μg/mL作为空白。

结果证实本方法的回收率较高，能够满足回收率>50%且RSD<20%的要求。

理论值 μg/mL	TOC实测μg/mL	盐酸林可霉素浓度μg/mL	擦拭回收率 %	平均回收率 %	RSD %
1.72	0.602	1.55	90.1	89.3	3.4
1.72	0.578	1.48	86.0
1.72	0.613	1.58	91.9

4准确度

按照实验方案直接配制理论为1.72μg/mL的盐酸林可霉素进行测试，测试结果如下：

理论值 μg/mL	TOC实测μg/mL	盐酸林可霉素浓度μg/mL	收率 %	平均收率 %	RSD %
1.72	0.677	1.76	102.3	101.6	0.6
1.72	0.670	1.74	101.2
1.72	0.669	1.74	101.2

实验结果能够满足准确度RSD ≤ 1% 的要求。

5精确度

选择理论残留限度作为精密度浓度的测试标准，平行测定6次，实验结果表明，RSD为0.44%，符合准确度RSD ≤ 2%

理论值ug/mL	TOC实测μg/mL	盐酸林可霉素浓度μg/mL	平均值ug/mL	RSD%
1.72	0.659	1.712	1.725	0.44
1.72	0.663	1.724
1.72	0.666	1.732
1.72	0.663	1.722
1.72	0.666	1.732
1.72	0.665	1.728

PART.4
实验结论

清洁验证应有足够的专属性和灵敏度，包括精密度、线性范围和回收率试验。一般要求线性范围应达残留物限度的50%-150%，精密度RSD 小于10%，回收率不低于50%。根据上述结果，通过计算得出检测限和定量限分别为0.518和1.57μg/mL，表明这两者均低于盐酸林可霉素注射液实际残留检测限度1.72μg/mL；擦拭回收率89.30% RSD3.4%能够满足回收率>50%且RSD<20%的要求；准确度0.6%能够满足准确度RSD ≤ 1% 的要求；精密度RSD=0.44%满足准确度RSD ≤ 2%。