美国药典第二版mRNA疫苗分析指导方案解析(一)
新冠mRNA疫苗的成功加速了有关mRNA疗法的研究活动。⽬前,国内已有两款mRNA疫苗获批上市,还有多项mRNA临床试验正在进行中。在mRNA疗法研究、开发和生产的过程中,需要建立稳定的分析方法来保障产品质量。为保证mRNA疫苗产品的安全、有效和质量可控,同时为全 球的mRNA治 疗产品开发和生产企业提供公共分析方法和标准的依据和技术资源,美国药典委员会(USP)与业内专家共同起草了《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》(第二版)。
相比第 一版,新版指南草案从整个mRNA疫苗产品的全生命周期出发,基于QbD(质量源于设计)的理念,对原内容进行了修订和补充。内容主要涵盖了:
质粒DNA质量属性的测试 - Proposed testing for plasmid DNA prior to release
mRNA药物原料的表征和放行测试 - Characterization and release testing for mRNA Drug Substance
mRNA药物制剂的表征与放行测试 - Characterization and release testing for mRNA Drug Product
其中与高效液相色谱(HPLC)及液质联用(LC-MS)技术相关的分析手段被用于各阶段的多个项目中,是mRNA疫苗开发及生产中不可或缺的关键技术。
表1. 《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》(第二版)中的高效液相色谱及质谱技术摘录。
完整mRNA的分子量较大,在分析之前通常需用核酸酶进行酶切处理。选择性核酸酶RNase T1在G核苷酸的3'端裂解RNA序列,产生相对较短的寡核苷酸混合物,随后可通过LC MS/MS进行序列分析。mRNA的poly(A)尾部不包含G核苷酸,3'poly(A)尾以长度为100-150 nt的寡核苷酸形式从mRNA中释放出来。
图1. mRNA结构示意图。剪刀指示RNase T1的推断性酶切位点。
分离长度相差单个核苷酸的长链寡核苷酸对聚丙烯酰胺凝胶电泳、⽑细管凝胶电泳或⾊谱⽅法均构成挑战。沃特世高效液相色谱分析方案可使这些问题迎刃而解。
高分辨率的IP-RP-LC分析poly(A)尾异质性
并鉴定主要寡核苷酸的长度
离⼦对反相液相⾊谱(IP-RP-LC)法是寡核苷酸分析的理想选择。目前的IP-RP-LC方法虽然能够轻松分离15-30 nt的短链寡核苷酸,但要分离长度40-60 nt的寡核苷酸已经较为困难,分离60-100 nt的寡核苷酸则更加困难。这是因为10 nt与11 nt寡核苷酸的电荷差异有10%,而100 nt和101 nt寡核苷酸的电荷差异仅1%,因此100/101 nt的分离选择性会降低。通过对的离子对试剂和色谱条件的优化,结合沃特世新推出的ACQUITY Premier BEH C18寡核苷酸分析专用柱(300 Å, 2.1×150 mm, 1.7 µm),沃特世科学家开发出了可用于RNase T1酶解后EPO mRNA(TriLink)和Fluc Beta mRNA(AmpTech)分析的IP-RP-LC方法。酶解产生的2-30 nt短链寡核苷酸在5分钟前洗脱,在12~35 min之间洗脱的poly(A)物质。长度为124 nt的峰组(蓝色 色谱图)代表EPO mRNA poly(A)尾的分析结果。红色的色谱图显示Fluc Beta mRNA poly(A)尾稍长,集中在128 nt峰附近。
图2. IP-RP-LC方法分离100 nt合成腺苷标准品(黑色 色谱图)、RNase T1酶解的EPO mRNA(蓝色 色谱图)和Fluc Beta mRNA(红色 色谱图)的结果。
使用100 nt腺苷标准品(图2,黑色 色谱图),根据保留时间评估寡核苷酸的长度。合成的100 nt腺苷标准品包含从全长产物中分离出来的n-x短链杂质。我们对图2中标记的80、85、90、95、99、100和101 nt物质绘制了线性趋势L(nt) = a × tr + b。L(nt)相对于保留时间tr的线性校正曲线如图3所示。利用该趋势估计在EPO mRNA和Fluc Beta mRNA酶解物中发现的主要poly(A)尾峰的长度L(nt)(比较图2和图3)。
图3. 使用100 nt合成腺苷标准品及其截断序列(图2中的黑色 色谱图;80、85、90、95、99、100和101 nt峰)建立校正曲线L(nt) = a × tr + b。根据该校正曲线计算mRNA样品中最主要的poly(A)尾峰的长度。
SEC(体积排阻色谱法)
评估poly(A)的平均长度
SEC体积排阻色谱是一种根据分子的流体动力学尺寸分离分子的方法。在SEC分析方法开发的过程中,沃特世科学家筛选了1.7或2.5 μm粒径的SEC色谱柱。实验结果发现ACQUITY UPLC BEH SEC 1.7 μm 125 Å色谱柱适用于分离2-25 nt寡核苷酸。ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å 1.7 μm色谱柱适用于20-150 nt寡核苷酸,而ACQUITY BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱可有效分离50-4000 nt核酸。
图4. 用RNase T1消化857 nt EPO mRNA(红色 色谱图)。消化产物、poly(A)尾和2 - 30 nt短寡核苷酸(蓝色 色谱图)用ACQUITY Premier蛋白SEC 250 Å,4.6 x 150 mm,1.7 μm色谱柱分离。
基于这一初步研究,选择ACQUITY Premier Protein SEC 250 Å 1.7 μm色谱柱进行进一步实验。图4显示,该色谱柱能够出色地分离未消化的mRNA与mRNA RNase T1酶切产物。基于合成腺苷标准品的校准,Poly(A)尾的长度分布如图5所示。对于30–150 nt长度范围内的寡核苷酸,SEC峰保留时间计算与poly(A)尾长度的校准趋势呈现线性。
图5b显示了使用合成RNA寡核苷酸(A)标准品进行SEC色谱柱校准。30、40和60 nt样品表现出高纯度,而50 nt寡核苷酸和100 nt标准中检测到许多合成杂质。与寡核苷酸(A)标准品(图5b)相比,可以观察到明显的poly(A)尾峰前向和展宽(图5a),这是因为聚(A)尾的异质性导致的。SEC方法无法解析 N-x和 N x poly(A)尾部变体。然而,SEC UV方法确实提供了对聚(A)尾峰中存在的主要寡核苷酸长度的简单估计。
图5. a)1970 nt Fluc-β mRNA(红色谱图)用RNase T1酶解。用ACQUITY Premier蛋白SEC 250 Å,4.6x150 mm,1.7 μm色谱柱分离消化产物,poly(A)尾和2-30 nt短寡核苷酸(蓝色 色谱图)。b) 使用合成 30、40、50、60和100 nt 寡核糖核苷酸 (A) 标准品进行 SEC校准。插图中显示了线性校准。校准曲线的外推用于近似更大的聚乙烯A尾的长度。
本次小编分享了能够简单、稳定地分析mRNA poly(A)尾长的IP-RP-LC/UV⽅法和SEC-UV方法。基于ACQUITY Premier SEC 250 Å蛋白分析专用柱进行poly(A)尾长分析,使用寡核糖核苷酸合成标准品进行SEC校准,结果在30-150 nt长度范围内呈线性。使用ACQUITY Premier BEH C18 300 Å寡核苷酸分析专用柱可以基于IP-RP-LC/UV分离长达150 nt的长链寡核苷酸,不需要进行质谱分析也可以作为潜在的质量控制分析方法。两种分离模式均采用了具有MaxPeak高性能表面的色谱柱,确保寡核苷酸物质获得稳定的回收率。
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