一柱多用 | 核酸药物全能选手DNAPac RP助你分析mRNA
核酸药物将药物治 疗拓展到了蛋白质之前的基因层面,mRNA 疫苗体液免疫与T 细胞免疫的双重免疫机制,提高了免疫活性。这些优势使得核酸药物成为继小分子药物,蛋白药物,抗体药物后的新一代创新药物。核酸药物特别是mRNA在新冠疫情大流行期间,同样发挥了巨大的作用,在核酸研发生产过程中,质粒纯度测定, mRNA序列确证、mRNA含量测定,mRNA帽子结构确定,mRNA的PolyA测定,mRNA的降解产物的研究等等这些需求,对于分析技术提出了更高要求,专用DNAPac系列反相色谱柱和离子交换色谱柱可以满足这些检测需求。
本文重 点分享离子对反相测定原液中mRNA含量的液相方法,方法考虑到mRNA本身存在较为复杂的二级三级结构,对流动相中离子对种类、PH、色谱柱温进行了筛选,进而得到合适的保留对称峰型。
01、筛选条件
02、图谱展示
图1. 三种离子对在PH=8.5下的谱图
图2. 7.0、8.5和10.5三个PH值下的谱图
图3. 柱温40℃、60℃和80℃下的谱图(整体图为右上)
03、仪器及色谱方法
04、方法稳定性的探讨
在mRNA分析中可能会遇到一些方法稳定性的问题,比如保留不稳定、灵敏度下降等,除了离子对试剂浓度变化引起之外,色谱柱污染也会导致上述问题。反相分离模式用于mRNA样品的分析常见的污染问题是残留。90%乙腈水做流动相,60℃的柱温下,以运行方法一半的流速清洗色谱柱10-20倍柱体积或者通过进样10 μL 0.1mol/L的氢氧化钠,以分析方法中A和B起始比例为流动相,等度运行5min,柱温和流速保持和方法一致,连续运行1-3针可以很好的解决残留问题。
05、结语
DNAPac RP色谱柱1500A大孔径聚合物微球可以耐受0-14的PH和100℃高温,同时可兼容紫外、MS检测器,非常适合分子量大的mRNA样品的表征,特别是含量测定、3’ PolyA 尾长和5’ Caping结构的确证。在此液相方案中己胺离子对试剂选择性Z 好,可参照本文条件,即25mMHAA,PH=8.5-乙腈体系,柱温60℃做一个快速的方法开发。
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《DNAPac RP结合Vanquish Flex液相应用于mRNA含量测定》
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