干货丨且看如何利用梯度洗脱方法一招破解出峰问题--原理篇
我们先来看一张图
通过一张直观的图来探讨今天的话题
这三张色谱图的条件如下:
测试物质为C1-C10的烷基胺同系列衍生的衍生的亚奈基苯并咪唑胺黄酰
这三张色谱图给您的直观感觉是什么?
●A图等度洗脱,95:5的甲醇水,10个峰在10min出峰,峰很尖锐(窄),可是基线不分离。
●B图等度洗脱,80:20的甲醇水,10个峰在50min出峰,后面的峰明显展宽,峰矮胖。
●C图梯度洗脱,所有物质在20min出峰,分离度和响应都良好。
这三张图看完后,您是否有如下疑问?
●等度洗脱,要么几个峰分不开,要么分开了,时间长,出现矮胖峰,等度洗脱不适合多组分分离嘛,同行告诉我多组分一般要使用梯度洗脱,这是为什么?
●梯度洗脱是怎么实现化合物在好的分离度下,又保持色谱峰不展宽,出现尖锐的色谱峰的?
●怎么设置梯度,怎么确定一个好的梯度洗脱方法?
为了解决大家的困惑,
我们今天就是要来探讨,
为什么多组分要使用梯度法,
梯度洗脱怎么优化。
对于多组分的检测,我们希望什么?
1、良好的分离度
2、好的响应,峰高和峰面积,色谱不展宽,得到窄的色谱峰。
首先,我们来看看影响色谱分离度的因素是什么?
这里给大家放上一个分离度的关系式:
式子中的R为分离度,k为容量因子,a为分离因子。
我们来回顾一下基本知识:
tM 为不被固定相保留的死时间,
tR为化合物的保留时间(从进样到出现浓度ZD值的时间),
tR’为化合物的调整保留时间。
容量因子:是化合物在液-固两相达到分配平衡时,组分在固定相与流动相中的质量比值,因此又被称为质量分配系数。
分离因子:分离因子是在同一色谱系统条件下保留的差异的量度
当α=1时,两个色谱峰具有相同的保留时间并共流出。
对于多组分,我们需的是,在一定的时间内将组分分离,并且得到一定的色谱宽度的峰(尖峰);那么想要良好的分离度,需要的是相邻的两个化合物能达到基线分离,首先看一下分离度公式,看看什么影响分离度:
其中:;我们可以看到,在同一色谱系统,两个化合物的分离因子,与此色谱系统下,化合物自身特性相关,当α越大,分离度也将越大。
而其中:
可见,K’增大,可以提高分离度。
我们知道,梯度洗脱程序在改变流动相的比例,以达到分离的目的,那么梯度洗脱究竟是怎么来影响分离度的呢?
我们以反相色谱系统为例,来看一下,当我们改变了流动相比例时,k’的变化情况。
这是一张反相色谱图中,化合物的lgk’与流动相中有机相比例的关系图,近似为线性的关系图。从这张图,可以看出,在反相色谱中,lgk’随着ψ比例增大,逐渐降低,k’也逐渐减小。
即: lgk’ =Aψ+B (A为曲线的斜率,B为截距)。
通过这张图,我们来说明为什么需要梯度洗脱,
对于化合物1,2
Ψ=0.45时,lgk1’ =0.97,k1’=9.33;
lgk2’=1.27, k2’=18.6;
如果我们使用等度洗脱,有机相的比率为45%,我们会发现,由于此时的k1’=9.33, k2’=18.6,k’都大于10,这个时候,化合物与固定相作用的时间较长,因此可以想象,在这个时候化合物1,和化合物2 出峰时间都比较靠后,而且由于强的作用力,导致流动相无法在一个短的时间内将化合物洗脱出来,因此峰都变得比较矮胖,也就是宽峰,如图:
对于化合物1,2
Ψ=0.65时,lgk1’ =-0.21,k1’=0.61;
lgk2’=-0.35, k2’=0.44;
如果我们使用等度洗脱,有机相的比率为65%,我们会发现,由于此时的k1’=0.61, k2’=0.44,k’都接近于0,此时化合物会被流动相快速带出,形成尖峰,但由于两个化合物得K'都很小,而且接近,会形成共流出物,而且,DY个峰出峰时间Z 好大于2tM(K’=0)值,反映得图如下:
那么如果是梯度洗脱,会怎么样呢:
在梯度洗脱过程中,K’的值会随流动相的变化而改变,化合物被流动相洗脱带出色谱柱到达检测器的保留时间,与化合物从进样开始,到流出色谱柱的这一段时间内平均的K’的大小,以及色谱柱长,流动相的流速等有关,而化合物是否能产生窄的色谱峰,则取决于物质在将要脱离色谱柱的时候,K’能否比较小(即与固定相的作用力足够小,能被快速冲洗出去)。
打一个比方:
一辆汽车和一辆摩托车,通过一个长度为Lkm的隧道,汽车初始速度为20Km/h,摩托车的初始速度为35km/h,汽车的加速度为1.5m/s2,摩托车的加速度为0.8m/s2,那么谁将先通过隧道,汽车能否实现超车?
其实如果隧道足够短,由于初始由于摩托车速度快,虽然加速度小,但是汽车整体的移动速度仍然小于摩托车,汽车的平均速度就小于摩托车的速度,在这个整体水平上,汽车就会比摩托车慢到达,例如:当L=100m时,汽车通过的时间为8.42S,摩托车通过的时间为7.78S。
相反,如果隧道足够长,那么汽车在这段距离上的平均车速就比摩托车快,那么汽车就能实现弯道超车,例如当L=1000m时,通过隧道的时间,摩托车为39.3S;而汽车为33S。
这个比方里面的长为L的隧道(不同的隧道长度反映了车子通过隧道的加速时间的长短,导致ZZ通过隧道的平均速度不一样),这个就相当于色谱柱长,初始速度就相当于初始流动相比例下的化合物的K’,加速度就相当于lgK’与ψ线性曲线的曲线斜率,我们通常说色谱柱柱子长度是一定的,流动相在梯度变化的过程中,在这个时间段内,那么相同的柱子长度,K’变化的速率不同(就如同车子的加速度一样),在整个色谱行为上的平均值K’(如同车子在通过隧道的平均速度V’),就不一样,如果在梯度变化的时间范围内,通过相同的色谱柱,K’的平均值越小,就越容易先被洗脱出色谱柱,因此我们不能光关注化合物的初始K’,还需要关注化合物的K’的变化速率,这就很好的解释了,为什么有的物质在同一根色谱柱上,在A梯度时,化合物X比化合物G先出峰,而在另外一个梯度时,却是G先出峰(形势发生了逆转)。ZZ谁先出峰,与这些因素有关,另外当接近隧道出口时,若汽车速度加到越快(相对于化合物的K’越小),那么汽车或者摩托车整体通过隧道的时间就越短(t=车身长度/车速),对应于此时化合物出峰的色谱峰宽度就越窄。
例如,车身长为2.5m,如果ZZ通过隧道时车速为23m/s,则汽车完全通过隧道的时间为:0.10S,如果这时候车速为15m/s,则汽车完全通过隧道的时间为:0.16S,我们看到,出隧道时,车速越快,车子通过隧道的时间越短,反映在色谱上,就是峰的宽窄了。色谱峰流出的峰宽度反映在色谱图上的宽度即t1-t0。
总结
1、对于容量因子K’范围很大的化合物组,分离可以优先考虑梯度洗脱。
2、多组分的分离策略,考虑合适的分析时间内,得到窄峰和好的分离度
3、梯度洗脱是利用变化的有机相比例,即强度不同,达到改变化合物在两相中的作用力大小。
4、lg K’与ψ近似线性关系
5、K’随ψ的变化趋势的不同,使得梯度洗脱将不同化合物在色谱上的保留时间差异拉大,甚至出现超车。
6、K’≈0时,化合物几乎与固定相无作用力,能快速通过色谱柱,产生尖峰。
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