Milli-Q®讲堂 | 为什么我的PCR实验又失败了?
Z近不少小伙伴和Q博士诉苦:
“为什么我的PCR实验又失败了?”
我们都知道,核酸酶通过剪切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解DNA和RNA,在不少实验中发挥着重要作用。但是在PCR实验中,因为需要完整的生物样品信息用于PCR、克隆、测序或基因编辑等应用,研究核酸时需要不含核酸酶的试剂和容器。那么,核酸酶通过减切核酸骨架中的磷酸二酯键来降解DNA和RNA。虽然有些核酸酶是有用的研究工具,但是通常科学家需要完整的生物样品信息用于PCR、克隆、测序或基因编辑等应用。因此,研究核酸的科学家需要不含核酸酶的试剂和容器。作为缓冲液和试剂的主要成分,水中也不应该含有核酸酶。
核酸酶到底来自哪里呢?
核酸酶在实验室中普遍存在,它们普遍通常存在于塑料制品和试剂中,甚至可能来自科学家实验人员自身(皮肤,唾液等),而且核酸酶非常稳定,很难灭活。因此,经常使用DEPC处理来去除它们。
如何去除实验中的核酸酶?
DEPC是一种有效的非特异性RNA酶YZ剂,用于RNase灭活,且被应用多年。用DEPC对溶液进行化学处理是一种非常有效的方法,但它存在以下缺点:
➤ 首先,DEPC是一种疑似致癌物质,因为它可能与嘌呤发生反应,因此需要谨慎使用;
➤ 时间和能源消耗。DEPC和核酸酶之间的化学反应需要一定的时间,为了破坏DEPC,需要对溶液高压灭菌。而高压灭菌需要消耗大量的水和电。
核酸酶到底来自哪里呢?
而超滤可以作为DEPC的替代方案生产无核酸酶水,处理方法方便安全。
经过测试,超滤(Milli-Q®Biopak终端过滤器)可以作为产生无核酸酶水的替代方法。这个过程使用中空纤维根据其孔径分离污染物。一次性滤头内含13000Da标准分子量(NMWL)的聚砜超滤纤维(如图1)。
图1:聚砜中空纤维用于Biopak®柱中的超滤
将核糖体RNA加入每个溶液中,孵育20分钟,然后用琼脂糖凝胶进行变性条件下的电泳。如图2,当使用超滤过滤RNA酶溶液时,rRNA保持完整。同时,使用常规DEPC处理RNase溶液也能防止rRNA降解。作为对比,当RNase溶液未处理时,rRNA被降解。这表明了使用超滤去除核糖核酸RNA 酶与通过DEPC 处理灭活RNase效果相当。
图2:经过DEPC、超滤、无处理的含RNase超纯水rRNA的凝胶电泳
Milli-Q®Biopak终端过滤器为分子生物学、生物化学和细胞培养等应用而设计,用于生产无热原、核酸酶、蛋白酶和细菌的水。为需要超纯水用于细胞培养、生物化学或分子生物学应用的科学家提供了方便而经济的解决方案。
图3:Milli-Q®Biopak终端过滤器
课堂总结
DEPC、超滤都可以对核酸酶进行去除。但与耗时又不安全的DEPC处理方法不同,通过水纯化系统的超滤终端方式(Milli-Q®Biopak终端过滤器)获得无核酸酶的水,是一种安全又便捷的方法。
这种方法对科研有很多好处:
■ 按需可取。有需要时,可以非常容易地生产新鲜无核酸酶的纯水。不需要提前订购瓶装无核酸酶的水,或花时间制备无核酸酶的水。
■ 低风险。不需要化学品操作。另外,由于没有在水中添加化学物质,所以没有其试剂干扰的风险。
■ 高纯度无核酸酶的水。超滤技术是从水中直接除去核酸酶,而不是仅仅使它们灭活。因为过滤终端被设计成直接连接到水纯化系统的出口,因此可以非常方便地获得无核酸酶的超纯水。
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