细胞培养的基本技术

一、清洗

新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗，以防各种有害物质对培养细胞损害。培养用的塑料器皿目前主要依靠进口，均已无菌密封包装，可直接使用。对于塑料瓶盖或胶塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自来水中浸泡和蒸馏水漂洗2～3次，晾干备用。细胞培养中的绝大部分器皿系玻璃制品，清洗过程为以下步骤。

1.浸泡新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。

2．刷洗浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。

3．酸浸刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。

4．冲洗浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不残余任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，烘干备用。要求干净透明，无油烟，不能残残余任何有害物质及化学药品等。

二、消毒

1.包装器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

2.消毒消毒灭菌随物品的不同，而采用不同的方法。

（1）紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

（2）消毒剂：操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内桌椅和物体的消毒可用0.1％新洁尔灭、过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。实验室、无菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高锰酸钾5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，房间密闭24h即可）。

（3）干热消毒：多用于玻璃器皿消毒，干热烤箱180℃45～60min。

（4）湿热消毒：培养液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa（121.3℃）高压灭菌15～20min。

（5）滤过消毒：用孔径200～450nm大小的滤板可除去培养液和试剂中的细菌和霉菌等。用200nm孔径的滤板通过两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。滤器分为负压和加压式两种。过滤的液体量很少时，可选用注射器微量滤膜滤器。

（6）60Co照射：不耐热的塑料制品或一次性用品的灭菌可经包装后，用γ射线照射消毒。

三、无菌操作

无菌操作是防止污染、决定培养是否成功的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到Zda限度的无菌。工作前对手部需清洗消毒，进无菌操作室时戴口罩和穿工作服。不能用手直接触及已消毒器皿内部。打开培养瓶前或封闭瓶口前须火焰烧灼瓶口等。

四、取材

取材应注意无菌操作，防止污染。污染组织应放入含两性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、链霉素（500μg/ml）的培养液中浸泡10～20min。取材后应立即进行培养。如因故不能培养时，应在无菌条件下，把组织块切成1cm3大小置于培养液中37℃贮存。存放时间不宜超过24h。

1．源自人体的肿瘤和其他病理组织的取材、贮存和运送须注意防止污染。

2．取血：多采用静脉血，注意无菌操作，如需应用肝素等抗凝剂，也要注意消毒处理。血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液，可采用离心法分离，500～1000r／min，离心5～10min即可。

3．动物组织：动物皮毛易隐藏微生物，且不易消毒，应特别注意无菌操作。

五、细胞分散法

1．机械分散对于脑、胚胎、肿瘤等软组织，先用组织匀浆器研磨组织，再通过细胞筛获得单细胞悬液。

2．胰蛋白酶消化适合于消化间质较少的软组织，传代细胞消化也常采用，是应用较广泛的消化酶，由于Ca2+和Mg2+对胰蛋白酶活性有一定YZ作用，因此须用不含这些离子的缓冲液配制。将组织剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍体积的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。

3．胶原酶消化对胶原有较强的消化作用，适用消化纤维组织、上皮组织及瘤组织等。胶原酶的使用终浓度为200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用缓和。一般将3～5倍胶原酶溶液加入已剪碎的组织块中，数小时或10余小时后，可见组织块逐步变小至几乎看不见，原来澄清的消化液转变成混悬液时，可以终止消化，如组织块较大、细胞量较多时，可于消化期间换消化液一次。消化液经低速离心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培养液，轻轻打散细胞团，制成细胞悬液。

4．EDTA溶液分散使用浓度为0.02%的EDTA溶液。常用于传代细胞的消化，作用温和，毒性小。

六、淋巴细胞分离法

取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀释后，沿试管壁慢慢加入4ml淋巴细胞分离液之表面，勿与分离液混合。然后2000r/min水平离心20min，管内分4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞(位于细胞分离液上界与血浆下界的中间呈白色雾状层)、颗粒白细胞(位于淋巴细胞分离液下界与底层红细胞上界的交界处)和红细胞(位于管底)。用毛细吸管沿管壁轻轻吸出的淋巴细胞层。然后用Hanks液洗两次，每次2000r/min离心10min，Z后计数供用。

七、细胞计数

待测细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色),混合后滴入血球计数板内。于低倍镜下计数4角的4个大方格内的活细胞(透明未着色)总数,然后用下式计数:

细胞数/每毫升原液=(4大方格内活细胞数/4)×104×稀释倍数

细胞存活率=(活细胞数/活细胞数+死细胞数)×100％

在计数时遇到对大方格压线的细胞，应按数上不数下,数左不数右的原则进行计数。

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