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- 【导读】一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)法测定蛋白质含量属于染料结合...
- 一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。
二、原理
考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)法测定蛋白质含量属于染料结合法。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,Zda光吸收在465nm;当它与蛋白质结合后变为青色,该结合物在595nm波长下有Zda光吸收。在一定蛋白质浓度范围内(0~1000ug/mL),其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质于考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡,完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年由Bradford建立的,试剂配制简单,操作简便快捷,反应非常灵敏,可测定微克级蛋白质的含量,是一种常用的对微量蛋白质进行快速测定的方法。
三、实验用品
实验材料:新鲜绿豆芽。器皿:(1)、分析天平、台式天平。
(2)、分光光度计。
(3)、离心机。
(4)、研钵1套。
(5)、离心管:10mL×1。
(6)、刻度试管:10mL×1或量筒:10mL×1。
(7)、移液管:5mL×1,2mL×1,1mL×2,0.1mL×3.
(8)、试管:10mL×14,试管架,洗耳球。
3、试剂
(1)、牛血清白蛋白标准溶液:准确称取100mg牛血清白蛋白,溶于100mL蒸馏水中,即为1000ug/mL的标准蛋白质溶液。
(2)、考马斯亮蓝G-250:称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL95%的乙醇中,加入85%(m/V)的磷酸100mL,Z后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
四、操作步骤
1、标准曲线制作
(1)、0~100ug/mL标准曲线的制作;取6支10mL的试管加入试剂,配制不同浓度的蛋白质标准液。
另取6支15mL的试管,从上述各试管中分别吸取0.1mL溶液,加入5mL考马斯亮蓝G-250,充分混匀,放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm波长下比色,记录各试管测定的光密度值并作标准曲线。
(2)、0~1000ug/mL标准曲线的制作
取6支10mL的试管,加入试剂。
其余步骤同操作步骤1,作出蛋白质浓度为0~1000ug/mL的标准曲线。
2、样品提取液中蛋白质浓度的测定
(1)、待测样品制备
称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中,加2mL蒸馏水研磨成匀浆,转移到离心管中,再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,洗涤液收集于同一离心管中,放置0.5~1b以充分提取,然后在4000r/min离心20min,弃去沉淀,上清液转入10mL的刻度试管,并以蒸馏水定容至刻度,即得待测样品提取液。
(2)、测定
另取2支10mL的试管,分别吸取样品提取液0.1mL(至少重复一次),加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂,充分混合,放置2min后用1cm光径的比色杯在595nm下比色,记录各管测定的光密度值,并通过过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X(ug)。以标准曲线1号试管做空白。
五、附注
考马斯亮蓝G-250法由于染色方法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。有些阳离子和有机溶剂存在时不干扰测定,但大量的去污剂存在时会严重干扰测定。蛋白质于考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速,反应在2min左右达到平衡,其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时,不可放置太长时间,否则将使测定结果偏低。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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