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目的和要求
掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。学习分光光度计的原理及使用法。
原理
1976年Bradford建立了用考马斯亮蓝G250与蛋白质结合的原理,迅速、敏感的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料Zda吸收的改变,从465nm变为595nm,光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数,因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度,Zdi检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程,大约需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子,如K+,Na+,Mg2+,(NH4)2SO4,乙醇等物质不干扰测定,而大量的去污剂如TritonX100,SDS等严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除。由于染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
操作步骤
一、标准方法
取含10~100μg蛋白质溶液于小试管中,用双蒸水或缓冲液调体积到0.1mL,然后加入5mL蛋白试剂,充分振荡混合,2min后于595nm测定光吸收值。以0.1mL双蒸水或缓冲液及5mL蛋白试剂作为空白对照。
二、微量蛋白分析法
取含1~10μg蛋白质溶液,用双蒸水调体积到0.8mL,加0.2mL蛋白试剂,充分振荡混合,2min后于595nm测定光吸收值,以0.8mL双蒸水及0.2mL蛋白试剂作为空白对照。用不同浓度的蛋白质溶液作标准曲线,以蛋白质浓度为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线作为定量的依据。
试剂和器材
一、试剂
1.标准蛋白质溶液:可用牛血清清蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度配制成1mg/mL的溶液。或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数A1%1cm=6.6来确定。
2.蛋白试剂的配制:称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇,加入100mL85%(W/V)磷酸,将溶液用水稀释到1000mL。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250,4.7%(W/V)乙醇,和8.5%(W/V)磷酸。
二、器材
1.72型分光光度计
2.微量注射器
3.试管及试管架
4.刻度吸管
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- 2004-09-07 09:23:12
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