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- 一、实验原理蛋白质含有两个以上的肽键(CONH),因此有双缩脲反应,在碱性溶液中,能与CU2+形成络合物。Folin-酚试剂反应是在双缩脲反应的基础上,引进Folin试剂(磷钼酸-钨酸试剂),蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂,生成蓝色物质。在一定条件下,蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较此外吸收法灵敏10~20倍,较双缩脲法灵敏100倍,反应约在15min内有Zda显色,并至少可稳定几小时。其不足之处是此反应受多种因素干扰。对双缩脲反应发生干扰的基团,Tris.HCL缓冲剂以及蔗糖、硫酸铵、巯基化合物,酚类及柠檬酸,均对此反应有干扰作用。在测试时应排队干扰因素或做空白实验消除。含硫酸铵的溶液只需加浓Na2CO3-NaOH溶液即可显色测定。若样品酸度较高,显色后色浅,则必须将Na2CO3-NaOH溶液的浓度提高1~2倍。本法可测定范围是25~250g蛋白质。二、实验用品(一)器材(1)722型分光光度计。(2)恒温水浴锅。(3)试管及试管架。(4)0.5ml,1ml及5ml移液管试剂(1)试剂甲。(A)4%Na2CO3溶液;(B)0.2mol/LNaOH溶液;(C)2%酒石酸钾钠溶液(或酒石酸钾、酒石酸钠);(D)1%CuSO4.5H2O溶液;临用前将(A):(B):(C):(D)=50:50:1:1(体积比)混合,此混合液即为试剂甲。混合后的溶液1d内有效。(2)Folin-酚试剂(试剂乙):在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4.2H2O),25g钼酸钠((Na2MoO4.2H2O),及700ml蒸馏水,50ml85%磷酸,100ml浓盐酸充分混合,烧瓶内加小玻璃珠数颗,以防溶液溢出,接上回流冷凝管以文火回流10h。回流结束后,加入150g硫酸锂(LiSO4),50m重蒸水及数滴液溴,开口继续沸腾15min,以除去多余的溴。冷却后溶液呈金黄色(如果仍呈绿色,须再重复滴加溴水的步骤),定容至1L,过滤,滤液置棕色瓶中保存,可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久,颜色由黄变绿,可加几滴液溴,煮沸数分钟,恢复原色仍可继续使用。使用时用标准NaOH滴定酸度,以酚酞为指示剂。该试剂的酸度应为2mol/L左右,将之稀释至相当于1mol/L酸度使用,即为Folin-酚试剂。(3)标准蛋白质溶液:可用结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量,再根据其纯度配制成500g蛋白/ml溶液。(三)材料血清使用前稀释100倍或约含20~250g蛋白/ml溶液。三、实验程序一、操作方法1.蛋白浓度标准曲线制作取14支试管,分两组按表9-1平行操作。绘制标准曲线:以OD650值为纵坐标,标准蛋白量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。2.样品溶液蛋白质浓度测定取6支试管,分两组,按表9-2平行操作。3、计算
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- 2004-08-27 09:23:05
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