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- 【导读】 生物柱离心式泰去内毒素超纯质粒小量抽提试剂盒说明书:washA,washB和washC:用前按照试剂瓶上标明的量分别加入分析纯异丙纯或95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖...
生物柱离心式泰去内毒素超纯质粒小量抽提试剂盒说明书:washA,washB和washC:用前按照试剂瓶上标明的量分别加入分析纯异丙纯或95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子。
用1mlddH2O(灭菌)完全溶解rna酶,将RNA酶放入水中煮,水沸后再煮沸20分钟,关掉火,缓慢冷至室温后,将RNA酶取出,全部加入solutionI,充分混匀后,将solutionI放入4℃保存.
使用本试剂盒可从1—10ml过液培养菌液中抽提10—40ug超纯度质粒(OD260/OD280≈1.8)。所得到质粒dna可直接用于转染、测序、酶切、克隆等分子生物学操作。无需酚抽提、乙醇沉淀、CsCl离心。
实验步骤:
将菌液倒入1.5ml eppendorf 管,5000rmp离心5分钟,弃上清液,倒转管子在吸水纸上砸几下,将残余液体去除。votex,加入250ulsolutionI,votex充分混匀。
加入250ulsolutionII,缓慢颠倒4次混匀,室温放置5分钟。(注意:solutionII天冷时会沉淀,若发现溶液变得混浊,37℃溶化后再用)
加入350ulsolutionIIIB,立即缓慢颠倒4次混匀,室温放置5分钟。
13000rmp离心10分钟。
小心将上清750ul吸入到一新的1.5mleppendorf管(注意:不要将白色沉淀吸到1.5mleppendorf管中。若发现有白色沉淀吸到1.5mleppendorf管中,将1.5mleppendorf管中的液体重新13000rmp离心10分钟,将上请液重新吸入一新的1.5mleppendorf管中。)。
加入75ul(1/10体积)solutionIV,缓慢颠倒3次混匀。放入4℃30分钟,中间缓慢颠倒混匀2次。
13000rmp离心10分钟。
将结合柱放入2ml离心管,小心吸750ul上清液于吸附柱中(沉淀很小,注意不要吸到沉淀),室温静置2分钟。
13000rmp离心1分钟,取出结合柱,弃2ml离心管中的废液,将结合柱再装入2ml离心管。
加入500ulwashA(用前加入分析纯异丙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,室温放置3分钟。13000rmp离心1分钟。弃2ml离心管中的废液。
将结合柱再装入2ml离心管中,加入650ulwashB(用前加入95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,13000rmp离心1分钟。弃2ml离心管中的废液。
将结合柱再装入2ml离心管中,加入500ulwashC(用前加入95%的分析纯乙醇,充分混匀,用后盖紧盖子)于结合柱中,13000rmp离心1分钟。
倒掉2ml离心管中的废液,将结合柱装入2ml离心管,13000rmp离心2分钟。
将结合柱装入一新的1.5mleppendorf管中(由于各厂家1.5mleppendorf管的口径不一致,管盖可能与结合柱的口径不匹配),室温放置数分钟以确保乙醇挥发干净。在膜ZY小心加入50ulTE。不要戳破膜。室温放置2分钟。
13000rmp离心1分钟,1.5m离心管中即为抽提的去内毒素质粒DNA。
注意事项:
1.提高洗脱液的温度(65℃左右)或将结合柱于室温或37℃水浴静置1分钟以上,可提高DNA的得率。
2.不要在结合柱上做标记,以免乙醇将字迹褪掉。
3.所有试剂用后盖紧盖子.
4.solutionII天冷时会沉淀,若发现溶液变得混浊,37℃溶化后再用。
5.本试剂盒通常情况下采用1-1.5ml过液培养的菌体进行质粒抽提。若所培养的菌体浓度较低或质粒在宿主菌中的拷贝数较低,可适当增加起始菌体的量至5-10ml,同时SolutionI、SolutionII、solutionIIIB的用量相应扩大,但要确定比例关系为5:5:7,其他试剂用量不变。
6.起始菌体过量可能会导致抽提的质粒质量不好,如质粒的得率较低,存在RNA或蛋白污染等问题。下列现象可提示菌体过量:
加入SolutionII混匀并静置5min,溶液没有变成透明;或溶液虽然已变透明,但颠倒离心管时发现溶液很粘稠或不均匀。
加入SolutionIIIB后,有大块物生成,离心时很难将其离到管底。
7.本试剂盒中,所用吸附柱Zda容量为700μl,对双链DNA的Z适吸附量为20μg。若经过SolutionI、SolutionII、SolutionIIIB处理并离心后的上清体积超过700μl,可对同一吸附柱分批上样多次。
8.操作步骤2、3、4中,加入SolutionII、IIIB之后,应尽量小心温和混匀样品;若混和剧烈可能会导致Z后抽提出的质粒超螺旋解开或双链发生断裂。
可以根据质粒提取的量来选择质粒提取纯化试剂盒,例如大中小级别的;此外也可以根据提取质粒的使用用途来选择,转染级别,测序级等纯化试剂盒。上海心语生物科技有限公司推荐质粒纯化产品大全:凝胶纯化试剂盒,磁性的质粒纯化试剂盒,微孔板质粒纯化试剂盒,质粒纯化试剂盒(Mega),酵母质粒纯化试剂盒。
- 2004-07-16 10:28:52
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