抗体／蛋白A或／蛋白G微珠层析柱的制备与常见问题

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【导读】抗体／蛋白A或／蛋白G微珠层析柱的制备与常见问题蛋白A／蛋白G微珠—抗体层析柱是用于抗原的亲和纯化最为通用的粒柱基质之一（Gersten和Marchalonisl...

抗体／蛋白A或／蛋白G微珠层析柱的制备与常见问题蛋白A／蛋白G微珠—抗体层析柱是用于抗原的亲和纯化Z为通用的粒柱基质之一（Gersten和Marchalonisl978，Schneideretal．1982，SimanisandLanel985）。此类层析柱容易制备，由于抗体分子是通过Fc功能区与基质结合，抗原结合位点的确切定向可与抗原Zda限度地发生作用。以下介绍的是设计用于蛋白质抗原的纯化，但类似的方案也适用于其他任何抗原。抗体可直接与蛋白A或蛋白G结合。根据抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力，可以选用蛋白A或蛋白G微珠。一般推荐将蛋白A用于与小鼠单抗IsG2a、IgG2b和IgG3亚类连接，而将蛋白G用于IsGl。蛋白G用于与大鼠单抗连接，对于各种多克隆抗体，蛋白A适用于家兔、人、猪、脉鼠、狗或猫的样本，而蛋白G适用于小鼠、大鼠、绵羊、马、驴、牛或山羊的多克隆抗体。一旦抗体与蛋白A或蛋白G微珠结合后，再通过双功能连接剂将其交叉连接到基质上。可以使用任何双功能连接剂，但大多数人使用二甲基庚二酸酯（DMP），因其价廉而且易于掌握。DMP的2种结合基团相同，都能与游离的氨基结合、由于碳分子骨架有很大的韧性，大多数抗体／蛋白A或蛋白G组合在合适的距离内存在反应位点，故能有效地结合。偶然不能有效结合，可以使用带有不同长度碳原子空隙的其他交连剂。常见问题当抗体的游离氨基是与抗原结合的关键部位时，应用这种方法可能出现某些问题。此时，交连剂经常与抗原结合部位结合而阻断其与靶抗原的相互作用。当偶联是成功的，并且在事先的工作中亦证明该抗体用于免疫沉淀是有效的，据此可以推断是由于偶联过程破坏了抗体与抗原结合的能力。出现这种情况时，可采用两种途径解决：使用较少量的交连剂以减少与抗原识别位点的作用，或者使用不依靠-NH2基团的其他双功能交连剂。上述方法可以先用小量的抗体与蛋白A或蛋白G结合进行试验，操作过程类似于下面将要介绍的方法。值得注意的是，在使用此类亲和层析柱时，柱内没有与抗体交连的少量蛋白A和蛋白G分子与抗原制品中的无关抗体发生作用。因此，当此类层析柱用于纯化来自哺乳类动物抗原时，也可以纯化抗原制品中出现的抗体。这些问题是由于在纯化的抗原制品中混杂有重链和轻链多肽造成的。开始时应用不含有抗体的抗原制品进行纯化，或者是在抗原纯化之前或纯化后通过蛋白A或蛋白G层析柱去除制品中混杂的抗体，可以避免这类问题的发生。有时结合反应不完全，这些可发生在由于DMP试剂贮存不当，或者是抗体制品中含有其他带有游离氨基的化合物。在检测结合效果时，上述步骤如发现少量的重链即说明有结合不完全，见步骤（7）。当出现这种情况时，先用100mmol／L甘氨酸（pH2．8）洗涤结合的微珠，可以去除任何非共价结合于蛋白A或蛋白G分子上的抗体。如果问题很严重，整个结合反应必须在设置对照的情况下重复进行，以发现问题出现的步骤。根据我们的经验，问题通常出现在使用贮存不当的DMP，或由于洗涤和结合缓冲液的pH值太低。

2004-07-19 09:04:13

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