西尼罗河热病原检测技术

（1）病毒分离可用鸟类的肾脏、脑组织、心脏以及马的脑组织（包括脑干）和脊髓进行病毒分离。供病毒分离用的细胞一般选用对西尼罗河病毒敏感的哺乳动物细胞系（如Vero细胞或蚊子细胞）。对病毒分离物的鉴定可以通过如下三种方法进行：一是使用病毒特异的单克隆抗体来进行间接免疫荧光试验；二是进行病毒的核酸检测；三是进行病毒中和试验。

（2）病毒的免疫学检测

①间接免疫荧光试验。用免疫荧光直接检出病变组织中的病毒，是病毒感染快速诊断的一个重要手段。采用该方法检测WNV需要病毒特异的单克隆抗体。取病变组织做冰冻切片或触片，做间接免疫荧光试验以检出病毒抗原。

②免疫组化（1HC）方法。对于疑似的致死性病例，其固定的尸体解剖材料，活检的材料和验尸的材料都应作免疫组化。其结果表明，脑组织坏死区内、神经元内、神经突触部均可检测到WNV病毒抗原。值得注意的是，在其他主要器官（如肺、肝、脾、肾）内未检出该病毒抗原。在死亡病例中，组织病理学损害和病毒抗原的免疫染色在脑干和脊髓为显著，这也可以解释有些病人出现的肌肉无力或瘫痪。

（3）分子生物学检测

①反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测技术。RobertLanciotti等对C蛋白基因的C末端和PrM基因的N末端进行序列分析，设计了一对引物，建立了检测WNV的RT-PCR方法，扩增片段大小为408bp。此法的特异性较好，除与日本脑炎病毒反应可扩增出同样大小的片段外，与其他所有的黄病毒反应均为阴性。但此法的敏感性相对较低，不能检测出人的脑脊液和血清及马的组织样品中的病毒抗原。美国未发现日本脑炎病毒，现已将此方法作为检测WNV的标准RT-PCR方法，主要检测人和鸟的脑组织中的WNV病毒抗原及蚊子样品中的病毒抗原。

②反转录巢式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测技术。RT-nPCR比RT-PCR具有更高的特异性和灵敏度。美国已有实验室开发了标准巢式RT-PCR和检测马组织的巢式RT-PCR方法。标准RTnPCR用于检测蚊子和鸟类组织样品中的病毒抗原，该法所用的模板是标准RT-PCR的产物进行10‘倍稀释后的样品，进行第二次扩增，片段大小为103bp。检测马组织的RT-nPCR主要检测马脑组织中的病毒核酸。该方法是按常规办法提取病毒RNA，然后进行两次PCR，对WNV的保守区-E蛋白基因区进行扩增。此方法目前已被定为检测马西尼罗河病毒感染的标准方法。

③实时荧光定量反转录PCR（Real-timeRT-PCR）检测技术。美国CDC实验室建立了以TaqMan探针为主的检测WNV的Real-timeRT-PCR技术。这方法设计了两套引物和探针：一套正向引物为5’-TCAGCGATCTCTCCACCAAAG-3，（1160-1180nt），反向引物为5’-GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-3’（1209-1229nt），探针为5，-TGCCCGAC-CATGGGAGAAGCTC-3’（1186-1207nt），扩增出E蛋白基因上一个70bp（1160-1229nt）的片段，特异性非常高，只能检测与WNVNY99毒株高度同源的毒株。另一套正向引物是5’-CAGACCACGCTACGGCG-3’（10668-10684nt），反向引物是5’-CTAO：（）C-CGCGT~GG-3’（10770-10756nt），探针为5’-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-3，（10691-10714nt），扩增出基因组3，端103bp（10668-10770nt）的片段，特异性和敏感性很高，可以成功扩增和检测所有WNV毒株。

④基于核酸序列的扩增（nucleicacidsequence-basedamplificationassay，NASBA，也称自主序列复制）检测技术。NASBA技术以PCR为基础，主要用于RNA的扩增、检测和测序，具有高度敏感性和特异性。该方法是一项连续的、等温的核酸扩增技术，扩增的反应体系中包括三种酶：反转录酶AMV、T7RNA聚合酶、核酸酶H，终产物是与模板RNA互补的单链RNA。美国的RobertS。Lanciotti等建立了检测蚊子和鸟组织及人脑脊液中WNV的NASBA-电化学发光法和NASBA-分子信标法。美国CDC已指明NASBA可作为一种诊断方法用于WNV的实验室诊断。

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