DNA产物纯化常见问题分析 solarbio

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【导读】DNA产物纯化常见问题分析常见问题可能原因建议解决方案未回收或回收率低胶块未全部溶解溶解凝胶时应该置于65℃水浴，不断上下颠倒，确定胶块完全溶解后再进行下一步操作。如果凝胶浓度较大...

DNA产物纯化常见问题分析

常见问题可能原因建议解决方案未回收或回收率低胶块未全部溶解溶解凝胶时应该置于65℃水浴，不断上下颠倒，确定胶块完全溶解后再进行下一步操作。如果凝胶浓度较大，可增加溶胶液使用量。胶块太大（>400mg）如果需要处理的胶块太大，应该先将其切成小块，做两次回收或选用大量型回收试剂盒。电泳缓冲液pH过高硅胶膜在高盐低pH值时可结合DNA，在低盐高pH值条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高，会导致DNA无法结合或降低结合率，可在溶胶后加入3MNaAc（pH5.2），将pH值调至7.0以下。漂洗液中未加入无水乙醇diyi次使用之前应该在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应该拧紧瓶盖，以免乙醇挥发，降低回收率。洗脱液不合适DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如TE和水；洗脱液pH值过低会降低洗脱效率，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间，当用水洗脱时确保其pH值在此范围内；洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率。洗脱液加入位置不正确洗脱液应加在硅胶膜ZX部位，确保洗脱液能完全覆盖硅胶膜的表面以达到Zda洗脱效率。洗脱体积太小洗脱液体积若小于30μl，则不易完全浸透硅胶膜，使洗脱效率降低；洗脱液体积若超过200μl，则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。洗脱时间过短洗脱时间对回收率也会有定影响，洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。回收后的片断无法用于后续试验，如连接等乙醇残留洗脱时硅胶膜上有漂洗缓冲液残留，会使洗脱产物中含乙醇，影响下游操作，在洗脱之前可通过再次离心或置于50℃烤箱中5-10分钟，彻底去除漂洗缓冲液中的乙醇。洗出液中污染有琼脂糖凝胶未全部溶解洗脱产物有ssDNA，表现为在琼脂糖电泳上呈现小的弥散带。将洗脱产物95℃加热2分钟，慢慢冷却到室温，使单链DNA重新退火复性即可。

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2004-11-06 09:23:09

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