质粒提取常见问题分析

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【导读】常见问题可能原因建议解决方案未提出质粒或质粒得率较低大肠杆茵老化请涂布平板培养后，重新挑选新茵落进行液体培养。质粒拷贝数低由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相...

常见问题可能原因建议解决方案未提出质粒或质粒得率较低大肠杆茵老化请涂布平板培养后，重新挑选新茵落进行液体培养。质粒拷贝数低由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。菌体中无质粒有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选所用抗生素种类和工作浓度是否正确。碱裂解不充分使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，此时可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。溶液使用不当溶液P2和P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温一段时间，直至溶液变为清亮后才能使用。质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。洗脱液加入位置不正确洗脱液应加在硅胶膜ZX部位，确保洗脱液能完全覆盖硅胶膜的表面以达到Zda洗脱效率。洗脱液不合适DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如TE和水；洗脱液pH值过低会降低洗脱效率，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间，当用水洗脱时确保其pH值在此范围内；洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率。洗脱体积太小洗脱液体积若小于30μl，则不易完全浸透硅胶膜，使洗脱效率降低；洗脱液体积若超过200μl，则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。为了得到较高的洗脱效率可以适当增大洗脱液体积。洗脱时间过短洗脱时间对回收率也会有定影响，洗脱时放置2分钟可达到较好的效果。碱裂时间过长加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。质粒纯度不高混有蛋白菌体不要过量。经溶液P1、P2和P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除。混有RNARNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3后室温放置一段时间。若溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。混有基因组DNA加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。含大量核酸酶的宿主菌宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，Z好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。质粒的二聚体和多聚体形式是在质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。乙醇残留漂洗液洗涤后应离心尽量去除柱中残留液体，并晾干吸附柱。如果DNA已经洗脱出来，可以用酒精沉淀DNA并风干，然后再溶解。

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2004-11-06 09:23:09

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