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产品品牌:免疫荧光(IF)服务|实验技术服务
测序实验流程:
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。
基本实验步骤:
(1)细胞准备:对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2)固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min.
(3)通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min.
(4)封闭:使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min.
(5)一抗结合:室温孵育1h或者4℃。PBST漂洗3次,每次冲洗5min.
(6)二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
(7)封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
注意事项:
1、染完之后没有封片前直接照一些,因为有的时候可能封片会出现问题,再想照反而没有了,另外不要拖太长时间,荧光会崔灭的。
2、荧光的片子一定要避光保存,保存的好的话,过一段时间仍然能照出很好的片子。
3、二抗用之前一定离心,不然有的时候有那种沉淀,在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点,非常难看。
4、整个操作在4℃下进行,洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN3,上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
5、洗涤要充分,以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合,出现假阴性。
6、加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体,降低和防止非特异性染色。
7、细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。抗淬灭剂可拿来直接封片,20微升即可,之后片子可保留更长时间。
常见荧光素的特性:
1、FITC:黄色结晶粉末,吸收光:490~495nm,发射光:520~530nm,明亮的黄绿色荧光。
2、RB200:橘红色粉末,吸收光570nm,发射光595~600nm,橘红色荧光。
3、TRITC:紫红色粉末,吸收550nm,发射光620nm,橙红色荧光。
4、镧系:Eu、Tb
5、PE:吸收光490~560nm,发射光595nm,红色荧光。
6、其它:酶作用后产生荧光物质。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-11-30 09:23:13
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