通用型细菌鉴定16S rDNA PCR扩增检测试剂盒

通用型细菌鉴定16SrDNAPCR扩增检测试剂盒产品说明书
主要用途
通用型细菌鉴定16SrDNAPCR扩增检测试剂是一种旨在根据保守性序列设计引物，针对微生物样本DNA进行PCR扩增，进一步测序后借助分析工具予以同源比较，由可变序列识别和分类微生物样品的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。可以被用于各种微生物的鉴定、归类、建树等系统微生物学的研究。产品即到即用，性能稳定，操作简便，扩增效率显著。
技术背景
16SrRNA作为非培养依赖性标记的分子指模（fingerprinting）技术，有别于传统的选择性培养技术，用于研究微生物的分类学（phylogenetics）。核糖体RNA（ribosomeRNA）存在于所有微生物体内，且结构与功能进化保留；容易分离和识别；其一级和二级结构具有高度进化保守区域（conservedregion）和物种特异性可变区域（variableregion）；其基因序列变异非常缓慢，且不会发生平行基因转移（horizontalgenetransfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不够充分；23S不稳定；而微生物16SrRNA基因较为稳定，初级结构含有1500个碱基。通过引物设计，扩增产物测序，数据库对照，鉴定微生物的类别或建立新的微生物在进化树上的位置。
产品内容
扩增液（ReagentA）微升
引物液（ReagentB）微升
补充液（ReagentC）毫升
测序引物A（ReagentD）微升
测序引物B（ReagentE）微升
产品说明书1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里；有效保证6月
用户自备
PCR级矿物油：用于封隔反应液
PCR仪：用于样品扩增
PCR管或平板：用于PCR反应的容器
琼脂糖凝胶电泳：用于扩增后电泳分析
实验步骤
实验开始前，从－20℃冰箱中取出试剂，放进冰槽里融化。然后进行下列操作：
1．针对一个样本，每次移出15微升扩增液（ReagentA）到PCR管
2．加入1微升用户自备的的待测DNA样品（总量100纳克）
3．微升引物液（ReagentB）
4．再加入微升补充液（ReagentC）（反应总量为25微升）
5．即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf5415）
6．（选择步骤）加入50微升用户自备的PCR级矿物油（注意：参见注意事项13）
7．即刻进行热启动PCR反应：
温度（℃时间循环
952分钟1
951分钟30
451分钟30
701分钟30
705分钟1
8．反应完毕后，移取5微升进行1.0%琼脂糖凝胶电泳：产物为1.5kb左右
9．如果继续测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用）
10．分别移出2微升用户自备的测序反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管
11．加入1微升测序引物A（ReagentD）到其中一个1.5毫升离心管，作好标记
12．加入1微升测序引物B（ReagentE）到另一个1.5毫升离心管，作好标记
13．进行后续的测序反应
注意事项
1．本产品为20次操作
2．操作时，须戴手套
3．建议使用带滤芯的枪头，避免污染
4．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融
5．建议样品为纯培养微生物的DNA；DNA提取应确保高纯度
6．可以使用菌落直接检测：用无菌枪头点触
7．如果没有扩增条带，可以直接测序，或询问特殊引物设计服务
8．可以直接使用纯化的基因组DNA进行测序
9．可以将扩增产物纯化后，克隆到质粒中，然后进行测序
10．测序引物A（ReagentD）为上游引物，可以获得500至1500的序列；引物序列为：
5－CAGCAGCCGCGGTAATAC3
11．测序引物B（ReagentE）为下游引物，可以获得0至500的序列；引物序列为：
5－GTATTACCGCGGCTGCTG－3
12．测序建议优先使用测序引物B（ReagentE），其可变区域较为特征
13．根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（MineralOil）
14．建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）
15．本公司提供16SrDNA特异性引物设计服务

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