PCR/RT-PCR基本原理及常用试剂耗

PCR/RT-PCR基本原理及常用试剂耗
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

PCR/RT-PCR常用试剂与耗材：

1.DEPC  10ml                sigma分装      原价：160

2.溴化乙锭EB  1g            sigma分装      原价：210 

3.噻唑兰MTT  250mg               sigma分装        原价：210

4.二甲基亚枫DMSO  100ml          sigma分装        原价：140 

5.Ivitrogen脂质体2000  0.75ml    Ivitrogen原装    原价：3100

6.0.2mlPCR管  1000支/袋          国产             原价：45

7.1.5ml离心管  500支/袋     国产   原价：45 

8.10微升、200微升、1000微升吸头, 以上吸头都是15元/包  1000个/包  赠送吸头盒一个。

9.RT逆转录试剂盒          20T        MBI原装                    原价：400

10.PCR试剂盒              100T       现在只有200T包装，MBI原装  原价：460 

11.100-1500bp DNA Marker  50T        北京天跟                   原价：160  货号：MD109-01

12.总RNA提取Trizol        100ml      Ivitrogen原装              原价：1900 

13.琼脂糖100g             100g       西班牙原装                 原价：460