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WB常用试剂是经典的HRP化学发光底物,化学发光底物主要考虑的是,发光信号强弱发光信号当然越强越好,强发光信号持续的时间也是越长越好,还有就是背景低灵敏度高。化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光,不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积,所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。目前Zgao检测灵敏度已经达到低飞克(Femto)级别而成为安全且灵敏度Zgao的WB检测方法。随着Cooled-CCD技术的发展,成像系统成本越来越低,因而在现在的实验室里这些设备越来越普遍。WB常用试剂使用温和的去污剂如吐温-20,或更换封闭剂(常用的脱脂奶粉、BSA、血清或明胶)。参照说明书,比对免疫原序列和蛋白序列以确保抗体和目的蛋白会发生反应,设置阳性对照。每泳道蛋白上样量不低于20-30μg,使用蛋白酶YZ剂并设置阳性对照。参照凝胶的配方,在凝胶中加入适量TEMED,放置时在凝胶顶部加入适量0.1%SDS(水稀释)以防凝胶变干。WB常用试剂可用软件半定量分析等优点,然而,这项技术应用于WB化学发光法显影还要求底物能产生高强度、长持续时间的信号,以被照相机捕获到。经过各大厂家的不断开发,现在的化学发光检测试剂从以前的发光时间持续几十分钟,到现在多数试剂可持续长达几个小时到一天,新的化学发光检测试剂盒很多兼容CCD成像检测,如果是实验室有CCD成像设备的不妨留意试剂盒是否有这种说明。发光时间的延长即使对于X底片的用户也是好消息因为压片显影后如果发现压片结果不理想,还可以多次重复压片而不需要重新反应。
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