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- 【导读】 常用内参介绍-多功能混匀仪技术文章常用内参介绍-多功能混匀仪技术文章(一) β-Tubulin抗体—做出漂亮WB和免疫荧光图片的内参Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。
- 常用内参介绍-多功能混匀仪技术文章
常用内参介绍-多功能混匀仪技术文章(一) β-Tubulin抗体—做出漂亮WB和免疫荧光图片的内参
Tubulin即微管蛋白,是细胞的一种骨架蛋白。Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin,其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体,是形成微管的*主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin分子量分别为55kDa和50kDa,其实际检测条带均在55kDa左右。作为内参,β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变,因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分子量*好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于β-Tubulin的检测分子量大约在55kD,因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。比如一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少,不适合做内参。
另外,我们还需要考虑自己的需要,特别是实验应用上的需要。一般来说,应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大,而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。另外,抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面,也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl β-Tubulin抗体(假如其WB检测的稀释比率是1:5000,*终使用液相当于500ml),要比效价低的1ml的β-Tubulin抗体(假如WB检测的稀释比率是 1:200,*终使用液相当于2ml)性价比更高。因此在选择抗体的时候,不但需要考虑抗体的量,还需要考虑抗体的效价,即不同应用的建议稀释比率。
(二)Actin即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,其余两种广泛分布于各种组织中,包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的,这是针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞浆内,表达量非常丰富,其含量占所有细胞总蛋白的50%。但是在一些少量特殊的情况下,如脂肪组织或细胞内,β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成,分子量大小为42-43kDa左右。
内参抗体虽然选择较多,但是也需要遵循一定的原则,并契合实际的应用要求。首先,我们需要考虑目的蛋白的大小,我们推荐内参要与检测的目的蛋白的分 子量*好相差5KD以上,因此你需要根据你目的检测蛋白的分子量来选择合适的内参,由于β-Actin的检测分子量大约在42kD,因此该内参抗体不是很适合 用于检测38kD-48kD大小目标蛋白的WB实验中。另外,虽然β-Actin是*合适的内参抗体之一,但是在某些条件下,一些因素也会导致样品间β-Actin含量的变化。特别需要注意的是,在脂肪组织里,β-Actin的表达量非常低,不适合作为内参。
另外,我们还需要考虑自己的需要,特别是实验应用上的需要。一般来说,应用类型越多,在使用过程中的选择余地就越大,而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外,抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面,也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl β-Actin抗体(假如其WB检测的稀释比率是1:5000,*终使用液相当于500ml),要比效价低的1ml的β-Actin抗体(假如 WB检测的稀释比率是 1:200,*终使用液相当于2ml)性价比更高。因此在选择抗体的时候,不但需要考虑抗体的量,还需要考虑抗体的效价,即不同应用的建议稀释比率。
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