超声波法破碎细胞的常见问题

问题：大肠杆菌表达外源蛋白质。超声处理时，将其悬浮在含1％triton-X-100的PBS中，然后超声效果更好。 1％的triton-X-100是有效的仍然很明显，它也可对链霉菌等其他细菌起作用。表达重组蛋白后，用冰浴，400w，2s持续2s和1s持续1s的超声波破坏细胞，但过一会儿产生大量泡沫，影响了破碎的能力。 pbs和tris缓冲区都是这样的。 *后，压碎不完全。 ，而目标蛋白在这些未破碎的细胞中，我该怎么办？

分析：（1）由于探头位置放置不正确，会产生气泡。

（2）探头必须靠近底部，大约0.5-1cm。

（3）功率因仪器而异，但是您可以观察液位，有波动但不太剧烈。

（4）您可以选择中断3s，停止10s，以及中断20-30次。

（5）注意喇叭的位置。如果您听到声音，则应及时进行调整。

（6）考虑细菌的浓度。压碎时请尝试增加体积，强度*不得超过60％。

（7）尝试中断8s，然后停止8s。对于某些细菌蛋白质，很难散发热量并使蛋白质变性以产生气泡。暂停时间可能会更长一些。这种情况在包涵体蛋白中更为常见。

问题：超声破碎链霉菌（放线菌）的条件是什么？

分析：放线菌属于原核生物的系统树上的革兰氏阳性细菌（真细菌）的分支群，在原核生物的系统树上具有较高的（G + C）摩尔百分比（mol％）。生物的分子生物学特征，但是细胞壁的化学组成在不同的组之间差异很大。进行大肠杆菌超声检查时，使用400W方法破裂5秒钟，然后停止5秒钟。效果很好，但由于细胞壁组成的差异，在链霉菌上使用时通常无效。

通常在超声分解之前将链霉菌（放线菌）制成一定浓度的细菌悬液。使用超声崩解时使用的具体条件是：

（1）取细菌的24h培养液，以5,000 r / min的速度离心5分钟以收集细菌。

Na（2）用pH 7.5 Na2HPO-NaH2PO缓冲溶液洗涤3次，然后使用该缓冲溶液将细菌细胞制成1：3的细菌悬液。将其放入40 mL大塑料试管中。

（3）将大型塑料试管放入冰浴中，并使用超声波破碎机（功率200W，1/2“探针，断裂30s，间歇30s）。

＆lt; span＆gt;＆gt;（4）将粉碎的液体以12000 r / min的速度高速离心30分钟，并收集细胞碎片和上清液。细菌也可用预冷的生理盐水或pH8的Tris-HCl洗涤，足以洗涤一次。另外，超声剂量随样品和细菌细胞的数量而变化很大。功率可以为400-600w，中断5s，停止5s，冰浴，并应添加ZZ浓度为1 mM的PMSF。为了确定适当的超声波强度和频率，有必要在任何时候通过显微镜检查观察细菌是否被完全破坏。