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- 【导读】人外周血TH1/TH2/TH17染色 注意:采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管,刺激剂尽量选用冻干粉自己配置;cocktail刺激剂是液体形式,PMA会因保存不当导致活性降低,影响...
人外周血TH1/TH2/TH17染色
注意:采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管,刺激剂尽量选用冻干粉自己配置;cocktail刺激剂是液体形式,PMA会因保存不当导致活性降低,影响刺激效果,而冻干粉形式的PMA较稳定,可以保证刺激效果。
人外周血TH1/TH2/TH17染色/流式检测方法
细胞刺激步骤:(刺激体系1ml)
取人外周血(肝素抗凝)200ml加入24孔板内,加入800ml的完全培养基,再加入1mlPMA(25ug/ml)、1μlIonomycin(1mg/ml),轻轻吹打混匀细胞。放入CO2培养箱培养刺激0.5小时后,每孔再加入2μlBrefeldinA(5mg/ml),轻轻吹打混匀细胞,放入CO2培养箱培养刺激3.5小时。
流式检测步骤:
1、收集细胞于流式管内,500g/8min离心,枪头吸去上清,弹散管底沉淀,加入相应的表面染色抗体(CD3\CD8),弹散混匀。室温避光孵育15分钟后,500g/8min离心,枪头吸去上清;
2、弹散管底沉淀,加入1ml的固定/破膜工作液,(1mlFixation/PermeabilizationConcentrate加入3mlFixation/Permeabilization Diluent稀释),旋涡混匀,现配现用;
3、室温避光孵育30分钟,600g/10min离心,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清(此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀,不容易丢失),弹散管底沉淀;
4、加入1mlPermeabilizationBuffer(此为10X,须与蒸馏水1:10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞,破膜15分钟(室温避光),600g/10min,在吸水纸上倒扣流式管弃去上清,弹散管底沉淀;
5、加入100μlPermeabilizationBuffer(1x),同时加入相应的细胞因子染色抗体,室温避光孵育15分钟;
6、加1mlPermeabilizationBuffer(1x),600g/8min;在吸水纸上倒扣流式管弃去上清;弹散管底沉淀;
7、加入适量体积(建议300~500ml)的PBS重悬细胞,并上机检测并分析。
注意:1、根据实验需求选择相应的抗体,并做单染管用于调节补偿(具体如何设置单染管,可参照Biogems流式手册补偿章节介绍)。
2、尽量做同型对照,因细胞因子表达量不高(尤其是IL-4表达量非常低),细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。
3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调,PMA与Lonomycin联合刺激下调非常明显,4h刺激后会下调50%以上,6h刺激几乎检测不到CD4,因此我们的界定CD4+T细胞是通过染CD3和CD8,来圈CD3+CD8-的细胞。
4、PMA对小鼠T细胞CD4表达影响很小,因此可以直接染CD4来圈门。
5、因破膜剂对细胞损伤较大,建议离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液,在加入破膜剂,这样会减少对细胞的损伤(形成的细胞碎片较少)。
人外周血TH1/TH17染色结果
注意:细胞破膜后对形态影响较小,因此可以直接圈淋巴门分析,在通过圈CD3+CD8-的细胞(此处未列出图)来分析CD4+的细胞表达细胞因子的量。因此此图横坐标就直接标的CD4。
人TH1/TH2/TH17染色所需抗体及辅助试剂
品牌
产品编号
产品名称
规格
价格
BioGems
05111-60
Anti-Human CD3 PE
25 test/100 tests
700元/
BioGems
10111-50
Anti-Human CD8a FITC
25 test/100 tests
560元/
BioGems
80811-80
Anti-Human IFN gamma APC
25 test/100 tests
1680元/
BioGems
81111-77
Anti-Human IL-4 PE-Cy7
25 test/100 tests
1890元
BioGems
73821-60
Anti-Human IL-17A PE
25 test/100 tests
1890元
BioGems
44212-80-100
Mouse IgG1 Isotype Control APC
100 mg
1750元
BioGems
44212-77-100
Mouse IgG1 Isotype Control PE-Cy7
100 mg
1890元
BioGems
44212-60-100
Mouse IgG1 Isotype Control PE
100 mg
1890元
BioGems
2031560-5mg
Brefeldin A
5 mg
880元
BioGems
5608212-1mg
Ionomycin (calcium salt)
1 mg
880元
BioGems
1652981-1mg
Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA
1 mg
880元
BioGems
92110-00-150
Permeabilization Buffer (10X)
150 ml
1030元
BioGems
92160-00-160
Transcription Factor Fixation/Permeabilization Diluent
160 ml
420元
BioGems
92550-00-50
Transcription Factor Fixation/Permeabilizatio Concentrate
50 ml
1050元
总价
17390元
方案提供:Biogems。Biogems是PeproTech的流式抗体品牌,优势是基于优异品质的较低价位,现正进行一系列促销活动。
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- 2004-08-13 09:23:10
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