4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷如何用于检测β-葡萄糖苷酶？ Megazyme 比色法用低聚糖 FAQs （3）

Megazyme比色法用低聚糖FAQs（3）

Q:4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（o-PNPBG）如何用于检测β-葡萄糖苷酶？

A:4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷按以下规程用于β-葡萄糖苷酶检测，不过缓冲溶液可以配合受检的酶溶液的pH值进行调整。

所需材料:

缓冲溶液:-0.1M醋酸钠缓冲溶液(pH4.0)。

酶底物溶液:4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（10mM）。
称量301毫克的4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷，加入150ml耐热烧杯中，加入95毫升0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH4.0)。搅拌溶液直至底物完全溶解（大约10分钟）。用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH4.0)调节体积至100毫升。加入0.02g叠氮钠以防止微生物污染。将溶液储存于一个密闭的Duran瓶中。日常使用时取10毫升加入聚丙烯试管中。注意不要频繁从酶底物储备液中取用。所有容器都应置于4摄氏度下储存。

酶制备液:
用GILSON的微量移液器精确将1.0毫升均匀的酶悬浮液转移到一个100毫升的容量瓶中，然后用0.1M的醋酸钠缓冲溶液(pH4.0)定容。接下来按照0.5毫升酶溶液和4.5毫升缓冲液的比例（10倍）稀释酶制备液，混合均匀，重复上述步骤直至获得适合分析的稀释液。

上述操作推荐使用Gilson移液器，预设0.5ml，用于转移酶制备液；Eppendorf多道移液器用于转移4.5ml缓冲液（5道设置为2.5毫升，4道设置为2毫升）。

检测过程:

40摄氏度下，预培养置于玻璃试管(16x100mm)中的酶底物溶液（0.2毫升）5分钟

40摄氏度下，预培养酶稀释溶液（约5毫升）5分钟。

严格按时间间隔（大约15秒），往含有0.2毫升底物溶液的试管底部加入0.2毫升酶溶液，剧烈震荡混合试管内容物，然后培养试管（一式四份）10分钟左右。

培养结束前，加入3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH12.0)终止反应，并剧烈搅拌。

准备反应空白溶液（一式两份），将3.0毫升2%的磷酸三钠溶液(pH12.0)加入0.2毫升底物溶液中，剧烈搅拌。然后加0.2毫升酶溶液，剧烈搅拌。

按以下步骤测量吸光度值(400nm):

-用蒸馏水校正分光光度计的零点
-检测反应空白样相对于水的吸光度，并记录(仅供参考).
-用蒸反应空白样校正分光光度计的零点
-检测所有其它溶液相对于反应空白样的吸光度

活性计算公式如下:

1个单位酶活性，是每分钟在Z佳pH和40摄氏度下将1微摩尔PNP底物水解成pNP和底物所需要的酶的数量。

按以下公式进行计算:

Units/mL=(ΔE400/10)×(3.4/0.2）×(1/18.1)×（100/1.0）×稀释体积
=ΔE400×9.39×稀释体积

此处:

ΔE400=吸光度(反应)吸光度(空白)

培养时间=10分钟

细胞总体积=3.4毫升

检测等分=0.2毫升

对硝基酚在2%磷酸三钠溶液中的EmM值=18.1

萃取体积=总体积为100毫升的萃取原液中有1.0毫升的酶

稀释体积=萃取原液进一步稀释体积

注意:-对于40Units/ml的β-葡萄糖苷酶溶液来说，进一步稀释“萃取原液”意味着稀释至10倍。

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