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- 【导读】来自清华大学、哈佛医学院和斯坦福大学等机构的研究人员,通过优化sgRNA的参数提高了CRISPR/Cas9系统在果蝇中的特异性和效率。研究结果发布在10月23日的《CellRepo...
来自清华大学、哈佛医学院和斯坦福大学等机构的研究人员,通过优化sgRNA的参数提高了CRISPR/Cas9系统在果蝇中的特异性和效率。研究结果发布在10月23日的《CellReports》杂志上。
清华大学医学院的倪建泉(Jian-QuanNi)博士和斯坦福大学的JinBillyLi教授是这篇论文的共同通讯作者。倪建泉的主要研究方向包括干细胞增殖与分化机制、细胞信号的调控与协同、细胞信号与表观遗传学,以及分子和遗传工具的研发。
在过去的几年里,人们见证了序列特异性的DNA核酸内切酶技术的惊人发展,其能够在模式生物中实现精确的基因组编辑,为大大提高我们对于发育生物学和疾病的理解带来了希望(延伸阅读:Nature:CRISPR技术在癌症领域大放异彩)。就成本、设计和效率各方面而言,CRISPR/Cas9系统相比于锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)都具有很多的优势。但尽管强大的CRISPR/Cas9系统有着广泛的用途,它的特异性和效率仍是用户群共同关心的两个问题。
一些哺乳动物细胞研究表明,单导向RNA(single-guideRNA,sgRNA)和基因组DNA之间核苷酸错配的数量、位置和分布是影响脱靶效应和诱变效率的主要参数。还有研究证实Cas9和sgRNA的表达水平共同影响了诱变效率和脱靶效应。但大多数的细胞系研究都没有独立评估Cas9和sgRNA,一项体内研究表明在某一Cas9表达范围内sgRNA参数是影响特异性和效率的主要因素。
近期,国内外的医学研究人员开发出了用于果蝇的CRISPR/Cas9系统。但还没有系统研究评估CRISPR/Cas9系统的效率和特异性。人们迫切期望能够对影响CRISPR/Cas9系统在果蝇中特异性和效率的参数展开系统性的调查。
在这篇文章中研究人员发现,脱靶效应并不存在于与sgRNAs有三个或更多核苷酸错配的基因组DNA区域。重要的是,他们证实了诱变效率与sgRNA的6个前间区序列邻近基序近端核苷酸(protospacer-adjacentmotif-proximalnucleotides,PAMPNs)的GC含量之间呈强正相关。
此外,研究人员证实通过按照他们确定的优化浓度注入精心设计的sgRNA质粒,可以在一个步骤中有效生成4个基因的突变。Z终,利用优化的参数他们通过同源介导的修复(Homology-directedrepair,HDR)生成了HP1a的无效等位基因,并获得了相比以前报告的要显著高得多的总诱变率。
新研究实了综合优化sgRNA有望大大简化在果蝇中的CRISPR/Cas9实验。仪器网-专业分析仪器服务平台,实验室仪器设备交易网,仪器行业专业网络宣传媒体。
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- 2004-09-01 09:23:07
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