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动态建模在上游培养工艺中的应用（二）

来源：Cytiva（思拓凡）分类：应用方案 2024-02-01 10:00:07 247阅读次数

书接上回，前文我们分享了? 动态建模方法在上游培养的原理及案例，今天继续搬运一篇好文，和大家一起学习动态模型和数据驱动模型在上游培养的结合运用。由于小编水平有限，只能对该文章进行较为浅显的解读，如果各位读者对文中内容感兴趣，欢迎查阅原文。

单克隆抗体的上游生产表达通常受多种因素的影响，如细胞株、温度、pH、培养模式等等。在培养过程中，工艺相关杂质如宿主细胞蛋白 (HCP) 和宿主细胞DNA (HC-DNA) 等可能会伴随产物表达或细胞凋亡而分泌进入培养上清。虽然大多数杂质会在下游纯化过程中得到有效去除，然而某些杂质依然难以去除并可能对产物造成负面影响：例如HCP可引发蛋白聚集。因此，理解工艺相关杂质对产物的影响，并对它们在培养过程中预测和控制非常重要。本文介绍了一种建模方法，将工艺相关杂质作为影响因素之一，以预测培养过程中产物表达。

研究背景

行业内使用的建模方法通常是在动态建模之前加一步数据驱动模型以调校模型中各项参数，如细胞生长速率等。而在现存的建模方法中，基础M-M动态模型考量了工艺相关杂质，即细胞碎片及其水解后残留物对培养效果的影响。同时，也有研究者曾运用数据驱动模型来预测HCP和HC-DNA的浓度，只不过其准确度有待提升。本研究创新性地运用了一种模块化的杂合建模方法，用以模拟单抗的表达，并涵盖了对细胞活率、葡萄糖和乳酸浓度，以及HCP和HC-DNA的模拟：

数据驱动模型作为其中一个模块来精确化乳酸对于CHO-MK细胞株的影响；

动态模型则作为另一模块对HCP和HC-DNA的浓度进行预测。

该建模方法对于加深研发人员对生物工艺的理解以及帮助更好地控制各项工艺参数有着积极的指导意义。

培养方法

图1：实验分组如上图所示。实验设计分组情况。A、B组取样检测的Z后一次葡萄糖浓度为0 g/L，该结果指示在Z后一次取样前出现了葡萄糖含量的骤降。

该实验中用到了以下三种细胞株：

CHO-MK 9E-1，用于A，B两组流加批次培养。该细胞株是一种新开发的细胞株，主要特征为快速的细胞生长和高表达量。A，B两组只培养了7-8天，原文中并未解释该设置的原因，小编推测是因为作者希望用这两组来验证该细胞株培养前期的表现。

CHO-K1 (ATCC) 用于C组流加批次培养，培养时长为常见的14天，培养在50L反应器中。

CHO-MK CL1001，用于D组灌流培养，是一种针对灌流培养新开发的细胞株。

A，C两组于50 L一次性反应器中进行培养，而B，D两组于2 L玻璃容器中进行培养。每组均表达同样的单抗分子，各组的培养条件各不相同，详见上图。细胞密度、单抗产量、葡萄糖浓度、乳酸浓度、HCP和HC-DNA通过每天取样进行离线检测。

杂合模型建模方法

图2总结了该研究的建模思路，该模型包括两个部分：细胞死亡前的细胞代谢物模拟以及细胞死亡后的杂质模拟。关于第一部分，细胞凋亡前的代谢产物模型，又包含两个模块。

模块一运用了模拟活细胞密度，抗体产量，葡萄糖和乳酸浓度等物料衡算方程。该模块以Badr等人所开发的模型为基础，然而该基础模型的运作有一个预设前提，即在补料前，补料后和灌流培养等不同阶段，方程中各常数不变，显然这不符合实际，因此它对于全生长阶段的模拟不够准确。

模块二是一个数据驱动模型，作为对模块一的校正，主要针对生长曲线上不同阶段的代谢变化。如此一来，该模型可以用于对不同培养模式，不同阶段细胞代谢状态的准确模拟。

图2：杂合模型作用机制流程概览：模块一为动态模型，建立在Badr等开发的模型基础上；模块二为数据驱动模型，用于对动态模型的校正；模块三为动态模型，用于对培养工艺相关杂质的预测。

由上图可知，对于该模块的运作流程，主要分为以下几个步骤：

通过一轮预实验培养获得的CHO-MK细胞株的生长数据，模块一方程中各项常数得以确定。

用该动态模型对更长时间和更大规模的培养进行预测，初步计算各项目标值。

结合前两步所得的数据（预实验的测量值和动态模型预测值），通过数据驱动模型对代谢产物浓度进行校正。

将校正后的代谢产物浓度反馈回动态模型，来调整该方程中的各项常数，进而对活细胞密度和单抗浓度进行更精准的模拟。

将校正后计算所得数值套用于模块三，一个用以模拟细胞凋亡状态和HCP，HC-DNA的动态模型。

前文所提及的模块一的动态模型方程如下：

图3：用于模拟细胞代谢情况的动态模型。

上图中方程1-5为物料衡算方程，6、7为Monod-type模型用以模拟细胞生长和凋亡比速率。图中各变量根据具体培养阶段的实验参数而变动，例如，X_v为活细胞密度，V为溶液体积，F_in为物料进料速率，此处则是流加批次培养中的补料速率或灌流培养中的灌流速率，等等。

模块二的数据驱动模型Z初是针对对乳酸浓度敏感的细胞株（如CHO-MK）所设计。在此研究中，作者运用了主成分回归 (PCR) 的分析方法。模型中所包含的输入变量如图4所示，包括在线检测的各项数据，例如pH和溶氧，以及从模块一中计算所得的动态变化数据。为了能更好地校正模块一的计算值，还要对模块二中的目标计算值，如乳酸和葡萄糖等代谢产物的浓度每天平行做离线检测，用于对该数据驱动模型进行回归训练。Z终通过对模拟计算和离线检测的对比，发现仅有一个点，即B组的Z后一次葡萄糖检测浓度偏离了该模型模拟的回归曲线（如图1所示）。

作者分析该偏差可能是因为在培养末期，B组细胞的糖耗量出现陡增所致。究其根本，这一现象或许是细胞活性出现急剧提升的表现形式。除此以外，并未检测到其余任何数值出现偏离。由于主成分分析 (PCA) 方法对于偏离数据的高度敏感性，该值Z终被排除于结果分析之外。综上，可得以下两个线性方程。公式8以计算葡萄糖和乳酸浓度，公式9以计算工艺相关杂质浓度。

图4：用于模拟细胞代谢情况的数据驱动模型。

建模结果

按照以上方法完成建模后，作者同时A至D四组实验分别进行了各项目标数值的离线检测，用以验证该建模方法的可靠性。对于葡萄糖和乳酸浓度，从图五结果可知，当排除了葡萄糖Z后一次检测值的影响时， R2分别为0.879和0.917，证明该数据驱动模型的可靠性。四组实验的各项数据，包含活细胞密度，单抗浓度，代谢物浓度以及工艺相关杂质浓度均取样做检测，拟合结果如图6（实验组A）所示，在经模块二校正之后，R2值Z低达到0.86（活细胞密度，图6c），Z高达到0.98（HCP和HC-DNA，图6f、图6g），证明该杂合模型的可靠性。

值得注意的是，乳酸浓度，尤其是死细胞密度以及与之相关的HCP和HC-DNA浓度，经过模块二的数据驱动模型校正后，其准确性大大提升，这与作者的预期一致，即常规的动态模型无法准确模拟细胞凋亡情况以及与之相关的杂质。其余三组拟合结果与A组情况基本一致。

图5：交叉验证结果证明数据驱动模型对葡萄糖和乳酸计算的准确性。该回归线的绘制已将偏离值排除。

图6：实验组A中，杂合模型，动态模型（未校正）与离线检测数据的拟合结果。

讨论

为了更好地理解该建模方法并将之用于实践，首先需要了解其背后的原理以及其使用的数学分析方法。前文所提及的主成分分析 (PCA) 是一种数学降维方法, 利用正交变换把一系列可能线性相关的变量转换为一组线性不相关的新变量，称为主成分，从而利用新变量在更小的维度下展示数据的特征。在上游细胞培养过程中，影响培养效果的变量众多，且往往多种变量相互关联并同时影响着Z终的培养效果。使用主成分分析可有效地筛选出对于工艺影响Z为显著的某几种变量组合。作者将细胞株、培养时间、温度、溶氧、补料速率等19种相关变量作正交变换，组成19种主成分，即19组不线性相关的变量组合。从图7结果可知，当主成分越多，模型中累积可解释的方差越大，意味着培养的效果可被该数学模型解释的信息越多，模拟准确性越高。当模型囊括9种主成分时，可解释性方差已经达到96%以上，考虑到建模的可操作性，便无需加入更多的主成分。

作者还对这9种贡献值Z高的主成分进行分类：细胞株和检测时间点（灰色）；模块一计算所得的细胞代谢状况（粉色），例如，细胞生长速率，葡萄糖浓度等；细胞生长坏境（绿色），例如，温度，溶氧和pH；培养操作因素（黄色），例如搅拌速度，补料速率，培养周期等。

图7：各主成分对模型可解释性方差的贡献率

作者对这9种主成分进行逐一分析，并选择各主成分中Z高方差贡献率的变量来对该主成分进行定义解读，以便于我们理解该主成分与细胞培养之间的联系。依据图8所示：

主成分1代表培养操作因素的对实验结果的平均影响，因为该主成分中方差贡献率Z高的5个变量均为培养操作因素，说明这些变量与主成分1相关性Z强；

遵循这个思路进行解读，主成分2代表模块细胞的动态表现与时间及培养环境的关联，值得注意的是，该主成分中溶氧的方差高达46%，表示溶氧与目标物浓度强相关；

主成分3代表影响细胞存活和死亡率的因素；

主成分4代表实验条件对细胞生长的影响；

主成分5代表实验条件对细胞代谢速率的影响；

主成分6代表营养供应与细胞能量代谢的关系；

主成分7代表细胞承受的物理压力和物质转运；

主成分8代表细胞生长与乳酸浓度的关系；

主成分9代表细胞株对葡萄糖浓度的敏感性。

杂合模型的优势与限制

在未经模块二中数据驱动模型进行校正前，我们发现模块一的模拟能力不够全面，尤其是当需要考虑乳酸浓度和工艺相关杂质的影响时。而乳酸浓度，HCP,HC-DNA等浓度又受到多种因素的影响，Z直接的有补糖速率，细胞代谢状态等。不仅如此，溶氧，pH，培养温度，剪切力等等多种因素都可能对以上三者产生直接或间接的影响，进而影响细胞生长和产物表达。正是因为这些关联因素的高度不确定性，我们有必要在建模过程中将代谢产物和杂质的影响考虑在内，以获得一个更准确的预测模型，例如该研究所开发的杂合模型。另外，建模方法在下游纯化工艺的开发也已经得到广泛运用，例如推出的Go Silico机理建模产品。上游如果能够通过建模的方法准确模拟出相关杂质的浓度，对于整合下游模型并开发出一套全工艺链的建模方法具有重要意义。

即使该杂合模型具有其独特的优势，但依然存在一些自身限制。

首先，在数据驱动模型方面，位于数据训练集之外的模拟测算结果或许不够可靠，该模型目前还只适用于已训练的范围。例如，虽然该模型已在其他实验中成功预测高达100 mmol/L的乳酸浓度，而针对CHO-MK 9E-1这种乳酸浓度敏感的细胞株，只模拟到20 mmol/L。并且不同细胞株，甚至不同克隆之间都可能存在生理特性上的差异，因此将此模型直接套用在其他细胞株上时可能存在风险，需要非常谨慎，不过这种建模方法本身是可以推而广之的。

其次，在杂质浓度模拟方面，该模型还存在一些开发空间以更好地反应模型背后的生理现象。比如，若杂质来源于不同的细胞死亡途径，凋亡或坏死，需要建立对应的模型，因为伴随细胞不同死亡途径所释放的杂质情况不尽相同。

Z后，对于HCP浓度的模拟也存在另一限制，即模型的分辨率。该模型将所有种类的HCP浓度视为一个整体进行计算，但实际上培养上清中可能存在上百种不同类型的HCP。而在下游纯化工艺中，结构和大小越接近目标抗体的HCP，分离难度越大，意味着该模型所给出的结果可能会对下游工艺开发产生一些误导。

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参考文献：

Elastic Net with Monte Carlo Sampling for Data-Based Modeling in Biopharmaceutical Manufacturing Facilities. Computors & Chemical Engineering 2015, 80, 30?36.

Hybrid Modeling of CHO Cell Cultivation in Monoclonal Antibody Production with an Impurity Generation Module. Industrial & Engineering Chemistry Research 2022, 61 (40), 14898-14909

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