腺相关病毒衣壳蛋白的肽图
//
使用腺相关V病毒(AAV)作为基因治疗中递送ssDNA的有效载体持续热门。
与任何蛋白质一样，病毒蛋白(VPs)也会受到翻译后修饰的影响，从而影响其稳定性、衣壳组装和整体功效。因此，肽图谱可以用来评估这些修饰的存在和鉴定。
AAV具有典型生物制剂所没有的额外复杂性。病毒衣壳是由三个衣壳或病毒蛋白组成的60蛋白二十面体，以1:1:10的比例(VP1:VP2:VP3)非共价组装。传统的肽消化方法足以产生预期的结果。虽然给定序列同源性，但是多肽重叠和不重叠序列信号强度的变化应该可预期。
在本应用中，我们分析了AAV5和AAV9的衣壳蛋白肽，使用Biozen Peptide XB-C18反相色谱柱用胰蛋白酶酶切。结果表明，Biozen Peptide XB-C18色谱柱具有良好的峰容量和分离能力，具有高水平的序列覆盖率。
样品制备
样品: | 20μL AAV浓度为2E13vg/mL |
变性剂: | 50%v/v 三氟乙醇 |
还原剂: | 2mM三羧酸乙基膦 |
孵育: | 70°C下30分钟 |
烷基化: | 2mM碘乙酰胺 |
孵育: | 22°C下30分钟, 在黑暗条件下 |
稀释: | 以100mM碳酸氢铵, pH8.25稀释4.5倍 |
酶解: | 1:25w/w Trypsin |
孵育: | 37°C下18小时 |
淬灭: | 0.4%v/v with 10%甲酸 |
浓度: | SpeedVacto浓缩至约25%Z终反应体积 |
复溶: | 加入等体积的25mM碳酸氢铵，pH为8.25 |
LC 条件
色谱柱: | Biozen 2.6μm Peptide XB-C18 |
规格: | 150x2.1mm |
订货号: | 00F-4768-AN |
流动相: | A: 0.1% 甲酸水 B: 0.1% 甲酸乙腈 |
梯度: | Time (min) %B 0 2 50.5 60 55.5 60 60.0 90 63.0 90 63.1 2 70.0 2 |
流速: | 0.3mL/min |
进样体积: | 1μL |
温度: | 60°C |
仪器: | UHPLC |
检测器: | MS |
MS 条件
Scan Type: | Full MS |
Resolution: | 70,000 |
AGC Target: | 3e6ms |
Maximum IT: | 200ms |
Scan Range: | 200 to 2000m/z |
Scan Type: | MS2 |
Resolution: | 70,000 |
AGC Target: | 1e5ms |
Maximum IT: | 200ms |
图1 Peptide Mapping of AAV5 VPs, 浓度6.7E12 vg/mL (约55 ng/μL).
Protein Name | #Peptides | %Coverage | # AAs |
>tr|Q9YIJ1|Q9YIJ1_9VIRU Capsid protein OS=adeno-associated virus 5 OX=82300 GN=cap PE=1 SV=1 | 193 | 93.6 | 723 |
图2 Peptide Mapping of AAV9 VPs, 浓度6.7E12 vg/mL (约55 ng/μL).
Protein Name | #Peptides | %Coverage | # AAs |
>tr|Q6JC40|Q6JC40_9VIRU Capsid protein VP1 OS=Adeno-associated virus 9 OX=235455 GN=cap PE=1 SV=1 | 205 | 92.7 | 768 |
结论：
使用酶解法对腺病毒衣壳蛋白进行酶解后，使用Biozen Peptide XB-C18色谱柱进行分析，可以覆盖92%以上的蛋白序列。
全部评论(0条)
推荐阅读
-
- 腺相关病毒衣壳蛋白的肽图
- 腺相关病毒衣壳蛋白的肽图
-
- 如何利用LC-MS完成重组腺相关病毒6型衣壳蛋白表征分析？
- 如何利用LC-MS完成重组腺相关病毒6型衣壳蛋白表征分析？
-
- 建议收藏 | 分析超速离心法检测腺相关病毒空壳率SOP
- 建议收藏 | 分析超速离心法检测腺相关病毒空壳率SOP
-
- 毛细管电泳技术专辑 | 毛细管凝胶电泳技术分析AAV衣壳蛋白的纯度
- 毛细管电泳技术专辑 | 毛细管凝胶电泳技术分析AAV衣壳蛋白的纯度
-
- 全新 Hypersil GOLD Peptide 色谱柱 | 一支解决肽图分析挑战！
- 尖端技术，即刻解决亲水性肽段保留不一致或序列覆盖度低等分析问题
-
- 技术进展︱使用一种创新的阴离子交换色谱法分离完整AAV衣壳和空AAV衣壳
- 为了应对AAV分析的挑战，东曹科学家们不断尝试改进分析方法和技术。
-
- 技术进展︱使用一种创新的阴离子交换色谱法分离完整AAV衣壳和空AAV衣壳
- 为了应对AAV分析的挑战，东曹科学家们不断尝试改进分析方法和技术。
①本文由仪器网入驻的作者或注册的会员撰写并发布，观点仅代表作者本人，不代表仪器网立场。若内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们立即通知作者，并马上删除。
②凡本网注明"来源：仪器网"的所有作品，版权均属于仪器网，转载时须经本网同意，并请注明仪器网(www.yiqi.com)。
③本网转载并注明来源的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点或证实其内容的真实性，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品来源，并自负版权等法律责任。
④若本站内容侵犯到您的合法权益，请及时告诉,我们马上修改或删除。邮箱：hezou_yiqi
上海心仪电子科技有限公司
沪公网安备 31011502008050号
参与评论
登录后参与评论