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- 暑气蒸人8y 2011-04-11 00:00:00
- (一)脾细胞 1.材料 (1)免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠。 (2)1640培养液 单克隆抗体制备流程 (3)2.5%FCS-1640营养液 2.操作方法 (1)拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2)将小鼠放于70%酒精中浸泡消毒,取出固定于板上,在无菌条件下取脾。 (3)把脾放入5ml含有2.5%FCS的1640液中,冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。 (4)用镊子轻轻挤压脾,做成脾细胞悬液,用毛细管将悬液移入小试管中。 (5)直立小试管3min,使大块的结缔组织下沉,把细胞悬液移入离心管中。 (6)以2.5%FCS—1640充满离心管,并以400g离心7min~10min(与此同时应开始制备细胞)。 (7)把沉淀用约10ml的新鲜培养液再悬浮。 (8)重复⑹、⑺步骤。 (9)计算细胞,以台盼兰染色用相差显微镜检查,活细胞数应高于80%为合格。 (二)瘤细胞 瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白,这样的瘤细胞融合后,可能影响或降低所分泌抗体的滴度,所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的瘤细胞。 选择瘤细胞的条件:①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系,以便两者的组织相容性抗原一致;②瘤细胞必须是静息状态,不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外;③瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,Z好106个细胞/ml;④生长速度快,繁殖时间短。常用的Balb/c小鼠产生的瘤细胞株有:①S194/5XXO·BU·1;②SP2/0—Ag14(简称SP2);③P2—X—Ag8·6·5·3(简称653);④FO以653Z为常用,它是由矿物油4-甲基-15烷(Pristane,降植烷)诱发出来的一种浆细胞瘤(MinerolOilplasmacytoma,MOPC)并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。瘤细胞一般由有关单位直接引入,保存于-195℃液氮罐中,试验时复苏、增殖、传代即可。由于瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶处理。为了防止出现返祖现象,在融合前,可将培养基内加入15μg/ml8-氮鸟嘌呤。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的瘤细胞,在室温离心(400g)10min,沉淀以2.5%FCS—1640液再悬浮并计数。 (三)饲养细胞 在体外的细胞培养中,单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖,必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖,加入的细胞称之为饲养细胞(Feedercell)。在细胞融合和单克隆的选择过程中,就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体,因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞,如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等,常选用腹腔渗出细胞,其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是:一方面做饲养细胞,另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片,为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。 1.材料 (1)小鼠(Balb/c或C57小白鼠)若干只。 (2)11.6%蔗糖溶液(经10磅30min高压灭菌)。 2.操作方法 (1)拉颈处死小鼠。 (2)70%酒精浸泡消毒10min。 (3)用手术剪将小鼠腹部剪开一小口,剥开皮肤,露出腹腔。 (4)用注射器将4ml11.6%蔗糖溶液注入腹腔,用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体,加入离心管。 (5)1000r/min离心10min。 (6)取上清,以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞,使每毫升含40万个活细胞。 (7)以1ml吸管将细胞种入微量培养皿,每孔0.05ml,含2万个细胞,放入CO2培养箱培养,即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少,则可以在细胞换液时再加入一些。
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热门问答
- 制备单克隆抗体的过程
- 尽量详细
- 制备单克隆抗体的生物技术有哪些?
单克隆抗体是目前使用最为广泛的抗体类产品之一,相比多克隆抗体来说,其具备特异性强、纯度高、重复性好而且能够大批量供应的特点,使得其得到了广泛的使用。单克隆抗体的问世,可以说为免疫学领域带来了一场革命,也从根本上促进了众多领域科学的发展。那么,对于单克隆抗体的几种研发技术,大家了解多少呢?
1、杂交瘤技术。
通过将具备特异性的B细胞与骨-髓瘤细胞想融合所产生的杂交瘤细胞,这里细胞不仅能无限增殖,还可以产生特异性抗体;
2、酵母表面展示技术。
通过将外源靶蛋白基因与特定的载体基因融合后导入酵母细胞中,诱导表达后,使得其分泌出目的蛋白;
3、噬菌体展示技术。
通过将外源蛋白或多肽基因序列插入到噬菌体外壳结构的适当位置,使得目的随着子代噬菌体外壳的表达而表达;
4、转基因动物技术。
将受体动物的一段基因切除,在将目的基因导入到动物基因中,使得其遗传信息发生变化,并能稳定地遗传给后代;
5、纳米噬菌体文库构建。
也就是我们常说的纳米抗体制备技术,通过免疫驼类生物所产生的一种小分子抗体;
这几种研发方法各自的优缺点有哪些?
1、杂交瘤技术。
优点:技术相对成熟,前期获得抗体也非常的简单;
缺点:后续的人源化及分子改造过程相对来说要繁琐很多;
2、酵母表面展示技术。
优点:完备的真核细胞表达筛选技术;
缺点:成功案例较少,技术有待完善;
3、噬菌体展示技术。
优点:通过高通量筛选能获得更多全人源抗体;
缺点:前期建库费时且费力;
4、转基因动物技术。
优点:技术成熟,而且成功案例相对较多;
缺点:限制较多,且需要人源化,周期长,成本高;
5、纳米噬菌体文库构建。
优点:分子小、穿透性强、温度稳定性高;
缺点:后续的分子改造过程更为繁琐;
总的来说,现阶段的单克隆抗体制备方式相对来说都各具优缺点,适合不同的使用环境和需求。所以,我们在后期进行单克隆抗体制备的时候,需要结合自身的情况以及后期的发展来进行综合考虑,只有这样,才能在在控制成本的前提下选择合适的抗体产品。
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