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AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

　　小鼠 L929 成纤维细胞的多细胞球体是在µ-Slide 球体灌注中创建的。在从细胞悬浮液中形成球体后，使用 ibidi 泵系统进行灌注。添加 ibidi Pump 可确保球体在长期培养过程中获得最佳营养。

　　在灌注培养 1 周后，将球体固定并用鬼笔环肽染色以观察 F-肌动蛋白细胞骨架。最后，球体被清除以增强成像深度和分辨率。我们使用EMOVI 方法进行具有成本效益、无害的整体成像，这可以在固定球体上实现基于抗体的多重免疫标记。球体的清除允许分析整个球体成纤维细胞甚至在球体成纤维细胞中心的成纤维细胞的分布和组织，同时保留球体的形态

　　01材料和试剂

　　细胞和试剂

　　•L929成纤维细胞（DSMZ，编号ACC 2）

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　•细胞培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　•细胞内 (IC) 固定缓冲液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　•Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS、Sigma、D8537）

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　•正常驴血清（Jackson，AB_2337258）

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼笔环肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，浓度20μg/mL，西格玛奥德里奇，D9542）

　　•去离子水 (diH2O)

　　•异丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　02缓冲液和溶液

　　培养基

　　•新鲜制备并在 4°C下储存长达一周

　　•基础培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　封闭和染色缓冲液

　　•PBS 

　　•1% （v/v）FCS 

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　染色液

　　•封闭和染色缓冲液

　　•1:500 鬼笔环肽（最终浓度 1x）

　　•1:10 DAPI（最终浓度 2 µg/mL）

　　30% / 50% / 70% (v/v) 异丙醇稀释液

　　•混合适当体积的 diH2O 和异丙醇

　　•使用前预冷至 4 °C

　　03 设备   

　　•ibidi 泵系统 (ibidi, 10902)

　　•具有生物惰性表面钝化的 ibidi µ-Slide 球体灌注（ibidi，80350）

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行连接器（ibidi，10830）

　　•ibidi 灌注套装蓝色 (ibidi, 10961)

　　•层流罩

　　•培养箱，37°C 和 5% CO2

　　•血细胞计数器（康宁)

　　•移液器(康宁）

　　•倒置共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）

　　•徕卡应用套件 X

　　•LIGHTNING（反卷积软件）

　　•Imaris v9.5

　　04 操作程序

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示.

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　点击请查看清除前后染色球体的直接对比视频 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　仅供科研使用！