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AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

       锂离子电池必须完全无水（水的含量小于20 mg/kg），因为水与导电盐(如六氟磷酸锂)反应生成氢氟酸。

       所有电池都由正极、负极、隔膜和电解液组成。对于锂离子电池，阳极和阴极材料(活性材料)被涂覆在金属箔上。为了覆盖金属箔，活性材料与粘结剂混合，并以浆料的形式应用于金属箔上。典型的负极材料是碳黑/石墨，而阳极材料是锂化合物。阳极、隔膜和阴极箔通常被缠绕或堆叠。因此，隔膜防止阳极和阴极之间的接触。阳极和阴极之间的导电性是由电解质建立的。一般选择无水的非质子溶剂和锂盐的混合物作为电解质。

       卡尔费休库仑法水分测定仪 可以可靠且准确的测定用于锂离子电池的几种材料的含水量。

       ·制造锂离子电池的原材料(如：电解质溶剂、碳黑/石墨)

       ·阳极涂层和阴极涂层的电极涂层制剂(浆料)

       ·已涂覆的阳极箔和阴极箔，以及隔膜箔和组合材料

       ·锂离子电池电解质

       瑞士万通公司在卡尔费休水分测定仪的制造及不同样品的卡尔费休水分测定方面有着丰富的经验。针对目前发展迅速的锂电行业，瑞士万通经过大量的实验和研究，推出了锂离子电池水分测定的解决方案。

电解质和溶剂

       大多数电解质溶剂是极性非质子溶剂。由于氢键的构造，用烘箱法提取此类溶剂中的水通常很慢。因此，只要它们不与滴定剂发生任何副作用，建议直接滴定这种溶剂。

       ◆ 正确的pH值范围和在无水甲醇系统内进行滴定是成功的关键。

       ◆ 电解质溶液是亲水的，应尽量减少样品暴露在空气中的时间。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

碳黑/石墨

       可以通过直接滴定测定碳黑/石墨中的水分含量，但是直接滴定样品会污染滴定池，带来需要经常清洗滴定池的烦恼。选择采用气体萃取的方式可以大大减少频繁清洗的烦恼。

       ◆ 进样针不能直接插入样品否则会造成进样针堵塞，应使用专用的进样配件。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 如果需要高准确度，推荐使用带隔膜的发生电极。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

阳极浆料

       用直接滴定法测定由石墨和n-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)制成的阳极浆料的含水量是不可能的，因为这类样品会产生干扰；因此，需要用气体萃取法进行滴定。

       ◆ 在样品中加入二甲苯，以降低样品的亲水性和粘度，使水分得到更好的释放。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 样品需充分搅拌，均匀的待测样品是得到重现性好的结果的关键。

       ◆ 蒸发的二甲苯会从样品瓶中被载气带入滴定池中。

       ◆ 进样针不能直接插入样品否则会造成进样针堵塞，应使用专用的进样配件。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。

已涂覆的阳极箔和阴极箔以及隔膜箔

       利用气体萃取技术可以很容易地测定已涂覆的阳极箔和阴极箔、隔膜箔和组合材料的水分含量。

       ◆ 试剂中所含甲醇会蒸发，应定期对甲醇损失进行补偿，以避免测定结果过高。

       ◆ 库仑法试剂的水容量有限，应注意监测试剂容量，适时更换。

       ◆ 使用惰性气体作为载气将释放出的水分输送到滴定容器中，通常使用氮气。

       ◆ 可以使用梯度升温程序，测定温度特性未知的样品。

       ◆ 相对漂移值不应高过5 μg/min。