液滴研讨会/网络课程：液滴微流控的动态分析
泰初科技（天津）有限公司-
微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。
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热门问答
- 液滴研讨会/网络课程：液滴微流控的动态分析
微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了微流控液滴的动态分析部分如速度场、表面活性剂等知识。
- 微流控液滴包覆应用之液滴测序（Droplet-Sequenc
细胞是生物结构和功能的基本单元，在类型和状态上有很大差异。在大多数生物系统中，我们对细胞多样性的认识是不完整的，就像神经系统（脑细胞）这样的复杂组织[1]。单细胞识别和功能的表征，作为对每个细胞的功能和反应的理解，将加速生物领域的发现。它可能是癌症、肿瘤，几何任何可能在细胞群中具有多样性的东西。然而，今天的技术并不能提供一种简单的方法来同时分析大量的单个细胞。快速、可扩展的液滴测序（Drop-Seq）这种方法可以用来表征具有许多细胞类型和状态的复杂组织。
Drop-Seq的原理和好处
Drop-Seq是一种基于使用微流体技术的方法，通过将它们封装在微小液滴中进行平行分析，可以快速分析数千个单个细胞。
这些纳升级水性隔离室已用于微流体器件中的许多应用：纳米颗粒制造、乳液和泡沫、药物输送，但也作为PCR和逆转录的微小反应室[3]。Drop-Seq使用液滴将细胞分隔成纳升大小的反应室，用于分析其mRNA转录物，同时使用分子条形码策略记住转录物的起源细胞。通过这种技术，一个科学家每天可以制作10000个单细胞库，实验并行进行且简单。因此，该方法将允许为已知细胞类别和新的候选细胞亚型产生基因表达的分子图谱。
Drop-Seq利用微流体的优势（1）很短的时间内有很高的吞吐量
（2）尽量减少昂贵样品的消耗
Drop-Seq包含以下步骤
1. 从组织中制备单细胞悬浮液
2. 准备条形码引物（或者在微颗粒表面或者在内部）
3. 使用微流体装置将每个细胞单独地与一个微小条纹的微粒共同包覆或封装在一个微小的液滴中
4. 一旦分离成液滴，裂解细胞，释放它们的mRNA，然后与引物（primers）杂交。
5. 打破液滴并产生STAMP（附着于微粒的单细胞转录组）
6. 放大STAMP
7. 测试和分析：使用STAMP条形码推断每个转录物的起源细胞Drop-Seq可以使用2种beads：
A：“简单”的微粒
B：水凝胶微粒
该项工作的ZD是“简单”微粒的使用，并简要介绍了水凝胶微粒，其原理保持不变。Drop-Seq使用简单的微粒
1. 从复杂的组织中准备单细胞悬浮液
将复杂组织解离成单个细胞2. 引物（primer）合成
微粒上的引物序列
每个微粒包含超过108个单独的引物，它们共享相同的“PCR句柄（PCR handle）”和“细胞条形码（cell barcode）”，但具有不同的独特分子标识符（UMI）。事实上，PCR句柄在所有引物和beads上具有相同的恒定的序列，这允许在STAMP形成后进行PCR扩增。细胞条形码，仅在相同微粒的所有引物上相同但与其他beads上的细胞条形码不同，允许回复细胞的起源。每种引物上不同的UMI允许对mRNA转录物进行数字计数并鉴定PCR duplicates。Z后，在所有引物序列的末端存在30bp的oligodT序列，用于捕获mRNA并引发逆转录。
细胞条形码的分裂和池合成（split-and-pool synthesis）
为了产生细胞条形码，将微粒库重复分成四个大小相等的寡核苷酸合成反应，向其中加入四个DNA碱基中的一个。然后，在每个循环后将微粒合并在一起，并进行总共12次分裂-池循环（split-pool cycles）。结果是一个微粒库，每个微粒具有4^12（16,777,216）个可能的DNA碱基序列之一。[4]
合成独特的分子标识符（UMI）
UMI的合成在“分裂-池（split-and-pool）”合成循环完成后进行。将所有微粒一起进行八轮简并合成，每个循环期间可获得所有四种DNA碱基，使得每个单独的引物接受4^8（65,536）种可能序列（UMI）中的一种。[5]
3. 微流体装置
一旦单细胞悬浮液和微粒准备就绪，使用定制设计的微流体装置将单个细胞与微粒一起包覆在液滴中。Image courtesy of Patrick Stumpf, Matthew Rose-Zerilli, Rosanna Smith, Martin Fischlechner & Jonathan West at the Centre for Hybrid Biodevices & Cancer Sciences Unit at the University of Southampton
该装置在它们分成离散的液滴之前连接两路水相。层流防止在液滴形成之前混合两种水相输入，一路流相包含细胞，另一路流相包含悬浮在裂解缓冲液中的条形码引物beads。微流体装置
组件列表
（1）倒置显微镜
（2）压力控制器+3流量传感器/三个注射泵
（3）3个falcon管/3mL注射器
（4）磁力搅拌系统
（5）用于实验装置元件连接的微流体导管
（6）微流体配件和连接器
（7）PDMS共流微流体液滴生成装置
（8）用于beads的100微米细胞过滤器
（9）用于细胞的40微米细胞过滤器
（10）计数室
实验装置连接示意图
4. 细胞裂解和RNA杂交
在液滴形成后，立即将每个细胞在液滴内裂解并释放其mRNA。然后，它们与其伴随的微粒表面上的引物杂交。
5. STAMPS产生
为了一次有效地产生数千个STAMP，通过添加试剂来破坏液滴以使油-水界面不稳定，并收集和洗涤微粒。然后将mRNA在一个反应中一起逆转录成cDNA，形成一组称为“附着于微粒的单细胞转录组（STAMPs）”的beads[6]。
6. STAMPS的放大
然后可以通过PCR反应在池（pools）中扩增条形码化的STAMP，用于高通量mRNA测序，以分析任何所需数量的单个细胞。
7. 测序和分析
使用高容量平行测序对每个末端对得到的分子进行测序。首先，将读数与参考基因组比对以鉴定cDNA的起源基因。接下来，通过细胞条形码组织读数，并且对每个细胞中确定的每个基因的mRNA转录物的数量进行数字计数。这是UMI发挥作用的地方，避免从同一mRNA转录物中重复计数序列读数。随后，可以建立数字基因表达测量矩阵（每个细胞每个基因一个测量）用于进一步的分析。使用水凝胶微球的Drop-Seq测序
关于水凝胶beads的使用，操作原理或多或少与以上保持相同，即Z大的区别在于引物（primers），它们位于微粒内而不是位于它们的表面上。
为此，微流体装置由三个通道而不是两个通道组成：
（1）带beads的一个通道（Z关键的部分）
（2）把细胞带入液滴的一个通道
（3）带来我们需要进行分析的化学试剂的一个通道
至于“简单微粒（simple microparticles）”的使用，水凝胶beads含有可用于逆转录反应的引物，然后随后对液滴内的细胞内容物进行条形码编码，由此获得作为RNA序列的拷贝的DNA序列的集合，并且现在通过它们来自哪一个液滴来对这些序列进行分类。
然后，可以打破液滴并将整个细胞群作为大量样品处理，知道每个细胞已被单独编码。
相关的资源
开源链接：McCarroll Lab液滴测序：Droplet-Sequencing
参考论文
[1] L. Luo et al., Genetic Dissection of Neural Circuits.
[2] B. J. Hindson et al., High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.
[3] N. R. Beer et al., On-Chip Single-Copy Real-Time Reverse-Transcription PCR in Isolated Picoliter Droplets.
[4-6] Macosko et al., Highly Parallel Genome-Wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.
- 网络课程：用于植物致病性真菌的单孢子微流控液滴包裹
微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。基于液滴的微流控技术可应用于单孢子或细菌类的包裹实验应用。本次网络课堂主要介绍了单孢子包裹/封装液滴用于致病真菌的研究。
应用领域：农业植物病理学、杀菌剂的发现与设计、杀菌剂筛选、杀菌剂的抗性和敏感性及分子-植物相互作用等
- 微流控双乳液滴/双包裹液滴制备
乳液（emulsions）是两种或两种以上互不相溶液体的混合物，其中，离散相以液滴的形式分布于连续相中。双乳液（double emulsion）则是一种分散相液滴中包裹着更小液滴的高度结构化流体，外液滴在内液滴的周围形成了一层屏蔽层，有效地隔离了内液滴与连续相，如下图所示。
双乳液又被称为乳液中的乳液或包裹性液滴，常见的类型主要分为W/O/W型和O/W/O型。以下图的O/W/O型为例，内部分散相和外部分散相为油相，中间相为水相，这种结构统称为油包水包油型双重乳液。
双乳液滴的主要优势：
（1）双乳液滴内部可以进行多种生物、化学反应，所需样品试剂量少、消耗低；
（2）在一定的工作条件下，双乳液滴的尺寸、数量可控，且可定量地分析内部的反应条件和结果；
（3）双乳液滴作为一个封闭的反应体系，避免了反应物浓度的改变以及不同反应之间的交叉污染；
（4）微乳滴的尺寸小，比表面积较大，传质、传热效率高。凭借这些特定的优势，双乳液滴广泛地应用于化妆品、药物生产、细胞医学、食品科学、石油工业、化学合成、环境监测等领域。
下面展示了我们利用玻璃毛细管开发的同轴流双乳液滴玻璃芯片和利用该芯片制备的双乳液滴。
利用该芯片，您可以快速、稳定的制备出80-200微米粒径均匀的双乳液滴。通过使用螺纹的倒锥接头，可快速、直接的连接到外径为1/16英寸（=1.6毫米）的PTFE导管上。
同轴流双乳液滴玻璃芯片采用高精确的对准方法将微细玻璃毛细管的ZX线处在同一个轴线上。三相流体的入口采用倒锥形接头连接，确保Z小的死体积和无漏液现象发生。该芯片由于采用玻璃毛细管加工，您可以把芯片放置在常规光学显微镜下观察乳液滴的产生过程。
双重乳液滴制备的实验连接图
首先，将OB1压力控制器、储液池、液体流量传感器、同轴流双乳液滴芯片和电脑等按照上图所示连接在一起。
其次，将实验用的液体放置在储液池1-3内。
Z后，在电脑上的ESI图形界面软件上设置OB1压力控制器输出的压力或液体的流量，同时在光学显微镜下观察同轴流玻璃芯片内的流体变化，然后慢慢调节压力或液体流量，直到双乳液滴的产生。
双乳液滴制备套装包含的组件
（1）微流控压力控制器OB1（三通道）（2）液体流量传感器MFS或BFS（三个）
（3）同轴流双乳液滴芯片（一个）
（4）样品储液池15mL（四个）
（5）微流控毛细导管PTFE（外径1/16英寸）
（6）微流控接头配件
您将从双乳液滴制备套装中获得的益处
（1）快速、稳定的压力驱动控制
（2） 快速、精确的液体流量控制
（3）图形化界面操作软件ESI
（4）液滴包裹的同轴流玻璃芯片
（5）实验自动化运行
（6）支持C++、LabVIEW、MATLAB、Python等API，方便您集成到已有的操作软件中。
（7）该套装适用于器官培养、细胞培养、流体操纵、流动化学合成等领域
（8）包含乳液滴制备的全部组件，您只需要提供50 cm×50 cm空间的实验台。相关介绍
微流控高精密压力控制器OB1介绍，请点击 这里
微流控精密液体流量传感器MFS介绍，请点击 这里
微流控高精密液体流量传感器BFS介绍，请点击 这里
微流控图形化智能操作软件ESI介绍，请点击 这里
- 在微流控毛细管中产生液滴
关于微流体毛细管中液滴产生的介绍
采用微流控技术来制备微液滴，除了采用微流体芯片如PDMS芯片、PMMA芯片、玻璃芯片外，还可以采用商业工具如色谱类工具来制造液滴。在这里，使用交叉结/十字结（cross-junction）或T型结（T-junction）来轻松制备微流控液滴，外形如下图所示。
这些工具分别是流动聚焦和交叉流动微流体方法的宏观等价物，主要区别在于微流体实验装置组建的时间。主要缺点是依赖于制造商，这意味着您无法精确选择通道尺寸，您必须在建议的尺寸（100 μm - 1 mm）之间进行选择。
有一个主要的微流体液滴制备装置协议，该协议描述了如何使用以下方法进行流体-流体分散：
A-流动聚焦方法（交叉结芯片）
B-交叉流动方法（T型结芯片）
微流体液滴制备装置的协议通常是一样的，在交叉点位置处引入两相流体，一相是连续相，另一相是分散相（液滴），如下图所示。T型结芯片处产生微流体液滴：
运动到毛细管中的微流体液滴：
不过，有几个细节可以区分这两种方法：
A-交叉结的流动聚焦
1、主要通道是液滴流动的通道
2、连续相垂直连接到主通道
3、分散相必须在主通道的连续性中连接到通道
4、用输入压力驱动的流量控制液滴尺寸
B-T型结的交叉流动法
1、主要通道是液滴流动的通道
2、分散相垂直于主通道
3、连续相必须在主通道的连续性中连接到通道
4、用输入压力驱动的流量控制液滴尺寸
总之，通过将亚毫米导管连接到亚毫米的T型和交叉型结器件上，可以像在微流体芯片装置中那样产生液滴，这是一种产生液滴的Z简便的方法。共轴流流动制备液滴方法没有简单的替代方案。但是，微流体液滴制备中使用的Z常见的两种制备方法（交叉流动法和流动聚焦法）却很容易用色谱工具来完成。液滴尺寸由导管和接头的特征尺寸预先确定。使用流动聚焦法（交叉连接）制备液滴，液滴尺寸具有更多的灵活性。参考文献[1,2]描述了液滴尺寸控制的方法。
参考文献：
[1] G. F. Christopher and S. L. Anna. Microfluidic methods for generating continuous droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics, 40(19): R319, (2007).
[2] A. R. Abate, A. Poitzsch, Y. Hwang, J. Lee, J. Czerwinska, and D. A. Weitz. Impact of inlet channel geometry on microfluidic drop formation. Phys. Rev. E, 80(2), (2009).液滴产生套装：专门用于满足研究人员Z常见的液滴生成需求主要特点：（1）高达10000个/秒（2）液体流量：0.1 μL/min到5 mL/min（3）液滴尺寸分散：0.3%（4）液滴含量的变化：100 ms
- 微流控双乳液滴或双包裹液滴制备套装
乳液（emulsions）是两种或两种以上互不相溶液体的混合物，其中，离散相以液滴的形式分布于连续相中。双乳液（double emulsion）则是一种分散相液滴中包裹着更小液滴的高度结构化流体，外液滴在内液滴的周围形成了一层屏蔽层，有效地隔离了内液滴与连续相，如下图所示。
双乳液又被称为乳液中的乳液或包裹性液滴，常见的类型主要分为W/O/W型和O/W/O型。以下图的O/W/O型为例，内部分散相和外部分散相为油相，中间相为水相，这种结构统称为油包水包油型双重乳液。
双乳液滴的主要优势：
（1）双乳液滴内部可以进行多种生物、化学反应，所需样品试剂量少、消耗低；
（2）在一定的工作条件下，双乳液滴的尺寸、数量可控，且可定量地分析内部的反应条件和结果；
（3）双乳液滴作为一个封闭的反应体系，避免了反应物浓度的改变以及不同反应之间的交叉污染；
（4）微乳滴的尺寸小，比表面积较大，传质、传热效率高。凭借这些特定的优势，双乳液滴广泛地应用于化妆品、药物生产、细胞医学、食品科学、石油工业、化学合成、环境监测等领域。
目前，双乳液滴的制备有传统的化学乳液合成法和微流控制备方法，微流控制备双乳液滴从液滴成型方式上可以分为主动式和被动式。主动式需要使用磁力、激光等外界动力进行乳化，对设备和成本要求较高。被动式可以通过微通道的结构设计和多相流的流速控制来控制流场，从而使两相流在界面张力、黏性力以及惯性力等综合作用下完成乳化。被动式制备双乳液的工艺主要有协流式（同轴流）、交叉流式以及流动聚焦式，如下图所示。
其中，协流式或同轴流方法主要是由多个共轴的微通道组成，其中，连续相包裹分散相呈同轴流动，相界面在R-P不稳定性的作用下产生波动，进而破裂形成液滴。当同轴流芯片的各个通道在同一个轴线上时，双乳液滴的尺寸均匀性和生成频率才能达到Z优。当前，同轴流芯片主要采用玻璃毛细管进行搭建。交叉流式主要是基于T形结构的微通道，其中，内流体以一定的角度进入外流体，在外流体的剪切力作用下将产生动量失稳，破碎成小液滴，连续的两个T形通道就能实现双重乳液的制备。流动聚焦式主要是十字型结构的芯片，主要是利用了毛细不稳定性来乳化液滴。如上图c中所示，由伯努利方程可知在窄缩口处流体流速会急剧增大，导致外相流对内相流对称的剪切力作用的增大，流体在窄缩口的挤压下产生聚焦效果完成乳化。
下图显示了交叉节点和流动聚焦方式制备双乳液滴的特点
下面展示了我们利用玻璃毛细管开发的同轴流双乳液滴玻璃芯片和利用该芯片制备的双乳液滴。
利用该芯片，您可以快速、稳定的制备出80-200微米粒径均匀的双乳液滴。通过使用螺纹的倒锥接头，可快速、直接的连接到外径为1/16英寸（=1.6毫米）的PTFE导管上。
同轴流双乳液滴玻璃芯片采用高精确的对准方法将微细玻璃毛细管的ZX线处在同一个轴线上。三相流体的入口采用倒锥形接头连接，确保Z小的死体积和无漏液现象发生。该芯片由于采用玻璃毛细管加工，您可以把芯片放置在常规光学显微镜下观察乳液滴的产生过程。
双重乳液滴制备的实验连接图
首先，将OB1压力控制器、储液池、液体流量传感器、同轴流双乳液滴芯片和电脑等按照上图所示连接在一起。
其次，将实验用的液体放置在储液池1-3内。
Z后，在电脑上的ESI图形界面软件上设置OB1压力控制器输出的压力或液体的流量，同时在光学显微镜下观察同轴流玻璃芯片内的流体变化，然后慢慢调节压力或液体流量，直到双乳液滴的产生。
双乳液滴制备套装包含的组件
（1） 微流控压力控制器OB1（三通道）
（2） 液体流量传感器MFS或BFS（三个）
（3） 同轴流双乳液滴芯片（一个）
（4） 样品储液池15mL（四个）
（5） 微流控毛细导管PTFE（外径1/16英寸）
（6） 微流控接头配件
您将从双乳液滴制备套装中获得的益处
（1） 快速、稳定的压力驱动控制
（2） 快速、精确的液体流量控制
（3） 图形化界面操作软件ESI
（4） 液滴包裹的同轴流玻璃芯片
（5） 实验自动化运行
（6） 支持C++、LabVIEW、MATLAB、Python等API，方便您集成到已有的操作软件中。
（7） 该套装适用于器官培养、细胞培养、流体操纵、流动化学合成等领域
（8） 包含乳液滴制备的全部组件，您只需要提供50 cm×50 cm空间的实验台。
- 微流控液滴产生套装-开箱即用&包含全部组件
（1）立即制备微流体液滴
打开箱子，连接装置，产生液滴。
（2）可再现的高单分散性
产生标准分散度＜2%的液滴
（3）适用于多种应用实验
聚合物颗粒，包裹/封装，微乳液等等
凭借该微流控液滴套装，您可以随时进行液滴产生实验并获得稳定的高单分散性液滴。
基于Z畅销的多通道OB1流量控制器，微流控液滴套装包含了研究人员从开箱即用的开始产生液滴和乳液所需的全部组件。微流控液滴为微流控技术带来了诸多优势如出色的单分散性、可重复性和可扩展性。
特色
微流控液滴套装使用2通道的流量控制器OB1中的一个通道泵送分散相流体，使用第二通道泵送连续相流体，从而使两相流体进入到微流体芯片通道内，利用微流体芯片内部的微结构形成油包水（W/O）或水包油（O/W）液滴。液滴尺寸由微流体芯片通道尺寸和两相的流速比决定。借助液体流量传感器MFS或者BFS，可以测量流体通路上的液体流量，或者利用闭环反馈功能，实现液体流量的恒定控制，将稳定的两相液体流量输送入微流体芯片内。
通过向微流控液滴套装中添加额外的压力通道和特定的微流体芯片，还可以进行高级的液滴实验，例如产生两种试剂的液滴、双乳液滴、聚合物胶囊等。
为什么利用微流控技术产生微液滴？
微流控技术对液滴尺寸可控及可重复性的产生，这是任何其他技术都无法实现的。恒定的液滴芯片结构尺寸和液体流速可产生单分散性小于2%的乳液滴。
此外，微流体技术是处理超小体积并控制进入每个液滴内的物质的理想技术。微流体技术可使您轻松灵活地产生具有相同含量的相同液滴或产生具有独特有效载荷的单个液滴。
配置您的液滴产生套装
1、为您的应用选择合适的微流体芯片
我们提供各种尺寸、规格和材料的芯片。2、选择合适的储液池大小
您是在处理小样品，还是正在研究生产100× mL的乳液？我们提供了与OB1流量控制器兼容的各种储液池，从1.5mL的Eppendorf管到100mL的玻璃瓶。
3、油和表面活性剂
为了产生wan美而稳定的液滴，我们还提供了多种油和表面活性剂。
对液滴细胞生物学感兴趣吗？
您是否要进行Drop-Seq液滴测序实验？细菌在液滴内生长？细胞包裹？您可以随时联系我们，以获取适合您应用需求的专用单细胞套装。
微液滴应用
（1）简单乳液滴
（2）双乳液滴
（3）水凝胶
（4）泡沫
（5）聚合物合成
（6）API封装
（7）药物输送
（8）纳米粒子
（9）单细胞包裹
（10）液滴测序Drop-Seq
（11）细胞培养
包含的组件
标准微流控液滴套装包含以下内容：
（1）2通道的流量控制器OB1
（2）2个液体流量传感器MFS或BFS
（3）1个微流控液滴芯片
（4）2个储液池
（5）所有必需的附件：导管、连接器、过滤器等
（6）1小瓶液滴生成油
（7）图形操作软件ESI（无限制的免费下载）
（8）用户指南包含液滴尺寸图，可让您选择合适的液体流速以获得所需要的液滴尺寸。
可升级选项：
（1）额外的流量控制通道OB1
（2）额外的流量传感器
（3）电脑
（4）显微镜和相机
微流体技术的主要优势可以应用于许多的液滴应用，因此，可以调整微流控液滴套装里的组件以适应您的特定需求。相关应用
Researchers’opinion on droplet generation in microfluidics: syringe pumps or pressure control ? [Review]
Generate droplets in microfluidics capillary [Application Note]
Droplet Sequencing (Drop-Seq) [Review]
Microfluidic flow focusing droplet generation [Application Note]
How to perform microfluidic droplets on demand [Application Note]
How to perform microfluidic droplets with droplet generation pack [Application Note]
Detection of fluorescent droplets using Optoreader
参考文献
High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device
Macromolecular Journals, D. Weitz et al.
Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics
Lab on a Chip, Nov 2015, A. J. deMello et al.
Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production
Scientific Reports, Sept 2017, G. Whyte et al.
Negative Pressure Induced Droplet Generation in a Microfluidic Flow-focusing Device
Analytical Chemistry, Feb 2017, Say Hwa Tan et al
- 制备快速、稳定的油包水液滴套装（Elveflow微流控）
微流控微液滴系统是微流控芯片领域的一个分支，其采用两种不相溶的流体在微孔道的界面处形成微液滴，微液滴的体积通常在nL - pL范围。微液滴由于具有体积小、无交叉污染、反应快速、装置简单、重复性好、易于精确控制等优点而得到了快速发展，其广泛应用于生物、化学、医学、材料等领域。
液滴微流控系统中两相流流体流动的长时间稳定性、快速响应性及操作的便携性对于微流控微液滴制备来说是必须要考量的一个事项。将两相互不相容的流体稳定而又快速的推进微流控芯片的通道内时需要使用微流控驱动泵比如哈佛注射泵（Harvard pump）、蠕动泵、压力泵（Elveflow OB1 MK3压力泵，Fluigent FlowEZ或MFCS-EZ压力泵）等。当制备的微液滴尺寸小于20μm时，压力驱动泵因其以气体压力驱动的快速性而比注射泵有很明显的优势。除了压力泵响应的快速性外，压力驱动泵还具有很高的压力分辨率、集成度高、操作简便等优势。
对于比较常见的两相流流体制备微流控微液滴来讲，我在此介绍一套微液滴发生器套装—Elveflow Droplet Generation Pack，该套装可满足大部分微液滴制备的需求。下面用该套装制备油包水液滴。实验装置
该套装产生的油包水液滴的如下图所示。
Elveflow微流控OB1压力控制器/压力泵结合流量传感器制备快速、稳定的油包水液滴视频如下：微流控液滴的应用
1、高分子合成
2、细胞培养
3、PCR
4、双重微乳液
5、水凝胶合成
6、RNA序列
7、单细胞分析
8、药物输运
该微流控液滴套装主要包含如下3件东西：
1、压力泵控制器/压力泵 OB1 MK3（2 channels - 2 bars）
2、PDMS微流控芯片
3、2个流量传感器
此外，还包括如下的其他东西：
1、油和表面活性剂 - 20 mL （HFE 7500 +2%活性剂）
2、15 mL储液池，包含储液池的盖帽
3、外径OD 1/32”导管
4、1/4” - 28的适配器
5、Luer locks适配器
6、1/16” OD外径的FEP微流控套管
7、压力源快速连接套装
8、气动聚氨酯（PU）柔性管
9、ESI Elveflow软件
Elveflow OB1微流控压力控制器/压力泵因其出色的性能而被用于如下微液滴制备的论文中
1、D. Weitz et al., Macromolecular Journal, High-Throughput Step Emulsification for the Production of Functional Materials Using a Glass Microfluidic Device
2、A. J. deMello et al., Lab on a Chip, Nov 2015, Controllable generation and encapsulation of alginate fibers using droplet-based microfluidics
3、G. Whyte et al., Scientific Reports, Sept 2017, Image-based closed-loop feedback for highly mono-dispersed microdroplet production
4、Say Hwa Tan et al., Analytical Chemistry, Feb 2017, Negative Pressure Induced Droplet Generationin a Microfluidic Flow-focusing Device
上述OB1 MK3制备油包水微流控液滴的详细介绍也可以参见Elveflow公司的如下链接：
Droplet pack - Easy Generation更加详细的内容介绍，请查看如下链接：http://blog.sina.com.cn/fangdzxx
也可以随时关注我们的微信公众号：信号测量与微流控系统
- 网络研讨会：微流控3D细胞培养
细胞的生长需通过各种复杂的外环境与内环境的协同作用共同完成，因此在建立体外生理学模型时需要考虑外界环境参数的真实性。 将微流控技术与微加工、细胞生物学相结合而产生的器官芯片技术在对外界环境参数的控制中具有其他技术难以比拟的能力，通过产生流体剪切力、机械应力、生化浓度梯度等理化刺激，细胞能够响应这些刺激而发生自组装，展现更加真实的生理学功能，因而在体外生理学模型建立中具有特殊的优势。微流控3D细胞培养技术由于实验耗材量小、实验速度快、占用空间小、费用低等而受到了高校研究所及各类企业研究人员的关注。
本次微流控3D细胞培养研讨会主要介绍了如下微流控3D细胞培养的5个内容：
1）相较于传统2D细胞培养，微流控3D细胞培养的优势
2）3D细胞培养的方法及芯片内部的通道连通性
3）Elveflow微流体OB1压力流量控制器与除泡器和细胞培养芯片的实验连接图
4）细胞介质溶液的恒温处理以及细胞培养芯片的恒温控制方法
5）微流控3D细胞培养的应用如血管形成、血管肿瘤模型、肿瘤的免疫反应、乳腺癌骨转移等。
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- 数字微流控：微流体液滴和乳液科学
- 根据Christopher和Anna[1]的说法“微流体技术提供了一种产生高度均匀的液滴和气泡的有效方法，也是一种操纵下游运动的便利机制。这些功能导致了一些使用其他技术无法实现的新应用的开发”。在过去5年中，采用微流体的乳液科学领域发表了超过25%的已发表论文。数字微流控是微流体的主要应用领域之一。微流体液滴的产生方法主要有被动或主动两种方法，大多数采用被动方法。在这里，我们主要学习被动方法，它们是基于流体的应用以使两种流体界面变形而产生微流体液滴。液滴几何形状微流体器件中产生微流体液滴的Z常见的几何形状是：1、交叉流动，通常称为T型结（T-shaped junction或T-junction）2、拉伸流动，通常称为流动聚焦（flow focusing）（使用交叉结/十字结，cross-junction），因为使用了通道的几何形状。3、共轴流动（co-flowing）两相流相遇的交叉点的几何形状，流速和流体的性质（表面张力，粘度等）决定了局部的应力，该局部应力使界面变形并导致液滴的产生。在具有微流体的乳液科学中，液滴基本上是在两种不相混溶的流体流的交叉处形成的。在物理上，受Rayleigh-Plateau不稳定性控制的两相之间的界面张力的影响允许形成液滴。在乳液液滴上施加剪切应用可导致其伸长，然后破裂。这一观察结果使Taylor将毛细管数Ca定义为剪切应力对表面张力的比值。向任何微流体液滴生成几何形状的交叉点处输送流体的方法主要有两种：注射泵和压力泵。我们将在这里描述液滴产生的常见方法：T-junction，流动聚焦和共轴流，然后凭借注射泵和压力泵在微流体中产生液滴。T型结结构中产生微流体液滴T-junction是产生微流体液滴Z常见的一种几何形状，Z初由Thorsen等[2]人在2001年提出。微流体T型接头中液滴的形成通常定义如下：连续相流过通道，而分散相通过垂直于连续相通道的通道。T-junction交界处有3种微流体液滴生成方式：1、dripping regime2、squeezing regime3、jetting regimeT型结结构产生微流体液滴的三种方式可由一种优于剪切应力和表面张力的参数来定义，因此，squeezing regime是低毛细管数（Ca<0.01）的两相系统之一。对于大多数毛细管数，它适用于jetting regime。dripping regime涉及到中间毛细管数。T型结结构产生的微流体液滴也高度依赖于构成微流体通道的材料的润湿性质[3]。
T-junction结微流控芯片产生的液滴
Dripping regime和T型结产生微流体液滴Thorsen等[2]和Tice[4]等在数字微流控领域的参考工作表明，微流体液滴的分离与趋向于保持分散相在其通道中的表面张力和倾向于通过剪切应力分离微流体液滴的粘性力之间的竞争有关。从毛细管数值（也取决于微流体液滴的半径R）达到临界值的那一刻起，微流体液滴就会破裂。Squeezing regime和T型结构产生微流体液滴Garstecki等[5]人的工作定义了低毛细管数下微流体液滴产生的行为。该行为以下列方式定义：在实验进行过程中，分散相倾向于堵塞主要通道，主通道中分散相的存在局部地降低了通道中的压力。当分散相上的压降变得太大时，微流体液滴发生分离。Jetting regime和T型结构产生微流体液滴在连续相流和两种不混溶流体之后的分散相在主通道中并排流动并破裂，液滴产SF生在两相流交叉点的远处。jetting regime可以产生较小的微流体液滴，但是，jetting regime并不容易获得，而且即使能够获得，其状态也不稳定。此外，当微流体液滴相对于微通道的直径变得非常小时，jetting system趋向于变得混乱[6]。无论您使用何种工作模式，所形成的的微流体液滴的大小都与上述介绍的两相流的流速成比例。通常，微流体液滴在微流体通道的壁上完全不润湿是一种优先选择的情况。压力控制器对每个液相的流量控制可产生具有高水平单分散性的液滴。压电式微流体发生器是控制流量和液滴产生的Z有效的压力调节器，如果您想了解更多关于压力控制器的信息，请单击 此处。优势：（1）使用方便（2）非常基本的几何形状（易于设计）（3）非常常见的几何形状（文献中描述了许多这样的系统）缺点：（1）难以形成微小的微流体液滴（小于通道尺寸）（2）不灵活（液滴尺寸由通道尺寸定义）T-junction产生的液滴：性能（1）高通量液滴产生：>100Hz（2）高度单分散性：尺寸分散性低至1%T-junction产生的液滴：技巧和窍门（1）克服气泡扰动（2）控制压力，使用流量传感器比使用注射泵能更精确地跟踪流速。（3）使用微流控切换阀可以轻松的实现液滴运动与停止状态的控制流动聚焦的微流体液滴生成diyi个微加工的流动聚焦系统出现在2001年[7]，直到2003年，流动聚焦几何结构才被应用于微加工的平面几何结构中，以形成油中的微流体水滴（油包水液滴）[8]。微流体液滴的产生如下：将连续相引入两个侧通道中，并将分散相注入ZX通道。通常，连续相的两股流体包围分散相的流体，连续相流体与分散相流体不混溶。连续相的两股流体通过几何约束迫使微流体液滴形成。流动聚焦结构芯片的液滴生成
流动聚焦几何形状的一个特征在于在微流体液滴形成期间可以观察到两相不混溶流体的变化，从而可以获得各种微流体液滴的大小，并且可以看到存在没有液滴形成的区域[8]。与T型结形状不同，流动聚焦几何形状产生的液滴没有简单的模型根据控制参数来预测微流体液滴的尺寸。另一方面，微流体液滴的产生频率通常相对较高，在kHz量级。然而，将jetting打破形成液滴通常会涉及到形成第二微流体液滴，其尺寸远低于主液滴尺寸，这种情况下产生的微液滴非常的不稳定，液滴尺寸难以控制。几何微流体流动聚焦系统有两种变体：（1）简单的交叉连接（2）交叉连接后有一个收缩受约束型流动聚焦几何形状的微流体液滴形成利用该变体，所有三个液体流都被引导至变窄位置处，从而产生微流体液滴[8, 10]。分散相在两个相反的连续相之间拉伸。产生的共层流通过收缩部分，收缩部分将其细化成射流（jetting）并且在收缩部分或收缩部分外的微流体液滴中引发射流的破裂。根据实验装置的控制参数，没有简单的法则来估计液滴的尺寸、分布和产生速度。实际上，与T型接头相比，增加了其他参数：收缩的尺寸，微流体液滴收集通道的长度和宽度。简单几何交叉结型中微流体液滴形成这种交叉连接几何形状中的微流体液滴形成以及两相流的影响在2008年便被进行了研究[9]。与T型结结构相比，T型结结构并没有被同化，我们认为只是添加了垂直通道而已。他们将流动聚焦变量和T型结接头之间的这些差异归因于T型结接头不对称而交叉结是对称的事实：通道壁被水/油界面取代。通道壁的影响在流动聚焦中受到限制，并且连续相的剪切力的影响增加。具有收缩结构的微流体流动聚焦系统的几何变体是Z常用的。它可以更容易地获得微小体积的微流体液滴。除了微流体流动聚焦系统的两种几何变体之外，还有两种使用流动聚焦的微流体液滴方案：（1）the dripping regime（2）the jetting system这两种模式之间的过渡取决于施加的流量和压力的强度，因此，其取决于毛细管数Ca和两相流速的比率。Dripping regime和流动聚焦产生微流体液滴在dripping模式下，微流体液滴在收缩处或非常接近收缩处破裂，并且破裂之后的界面保持在收缩区的相同位置。在该方案中，如果毛细管数非常高，则液滴的直径小于收缩的尺寸，并且微流体液滴的尺寸具有高度的单分散性。小毛细管数意味着乳液具有更大的多分散性[11]。随着毛细管数的增加，液滴直径减小，流量比减小。此外，此种模式还可以形成非常小的微流体液滴，即其尺寸远小于流动聚焦结中的通道尺寸。允许获得这些尺寸的微流体液滴技术称为流（tip-streaming）。流是液滴生成的一种方案，其中分散相的形状是尖的，并且非常小的微流体液滴从分离。Jetting regime和流动聚焦产生微流体液滴随着毛细管数的增加，会逐步的从dripping regime过渡到jetting regime。在该方案中，分散相沿着射流从孔口延伸的距离至少是收缩部分尺寸的三倍。这种射流的界面会有涟漪出现并且会逐步增多，直到其破裂成微流体液滴。产生的微流体液滴与射流的大小成比例。得到的微流体液滴大于dripping regime下获得的微流体液滴，并且尺寸更不均匀，因为在断裂后，界面的位置不固定[12]。Z后，在与微流体液滴形成的相关工作中，您还应该考虑其他参数的影响。对于流动聚焦系统来说，表面活性剂的浓度在某些液滴生成模式中占据了非常重要的地位，这已经得到证实[13, 14]。这些研究证实，随着表面活性剂用量的增加，液滴尺寸减小。此外，分散相对通道壁的润湿性比T型结接头强烈影响射流形成和破裂动态的情况起着更为关键的作用。优势：（1）使用方便（2）简单的几何形状（3）易于获得微小液滴的体积（4）灵活的液滴尺寸缺点：（1）不可预知的液滴尺寸（2）零散的伴随小液滴（3）多分散性流动聚焦微液滴：性能亚微米微流体液滴流动聚焦产生液滴：技巧和窍门（1）克服气泡扰动（2）压力控制器优于注射泵的优势在于跟踪液体的流速：使用流量传感器（3）使用微流体阀可轻松实现微液滴的运行和停止状态的控制共轴流产生微流体液滴这种基于同心微通道原理的液滴生成方法已于2000年首次实施[15]，这是微流体液滴合成中使用Z少的一种方法。它包括将分散相注入位于另一个具有Z大尺寸的微通道中间的ZY微通道中。分散相在Reyleigh-Plateau阶段变得不稳定并且会分裂成液滴，液滴的形成取决于含有分散相的微通道的直径[16, 17, 18]。从浸入到连续共轴流液体中的毛细管的液滴破碎情况来看，破碎方式可以分成两种不同的方式：dripping，液滴在毛细管附近被夹断，以及jetting，液滴从毛细管延伸部分的螺纹下游被夹断[19]。当连续相速度增加到临界值以上时，就会发生从dripping到jetting模式的过渡。液滴尺寸已被表征为控制参数的函数。通常，当连续相速度更快时，施加在界面上的较大剪切应力导致液滴的尺寸较小。液滴尺寸通常随着分散相流速的增加而增加。在夹断期间，新出现的液滴会继续填充，因此，较大的内部流速导致在夹断之前进入液滴的体积更大。在实验中，随着连续相速度的增加，液滴直径单调减小。由于降低的抗破碎型，降低的界面张力会导致更大的液滴。另一方面，在大范围的连续相速度范围内，粘度比的变化对液滴尺寸几乎没有影响。与流动聚焦的几何形状一样，使用共轴流方法可以产生亚微米的液滴。它也是流技术（tip-streaming technique），可以产生微小的液滴。Suryo和Basaran证明了这一过程的发生是由于成形液滴附近存在非线性拉伸流[20]。优势：（1）非常简单的几何形状（2）易于获得微小的液滴缺点：（1）将一根小毛细管插入到另一根毛细管中（2）零散的杂碎极微小液滴（3）微流体芯片上流体连接的设计（4）死体积高（特别是连续相）共轴流产生的液滴：性能（1）高吞吐量的液滴生成：>10 kHz（2）高度单分散性：尺寸多分散性<2%（3）快速的液滴量切换共轴流产生的液滴：提示和技巧（1）克服气泡扰动（2）压力控制：使用流量传感器比使用注射泵会更准确地了解液体流量（3）使用微流体切换阀可轻松实现液滴的运行和停止状态的控制微流控液滴产生套装：专门用于满足研究人员Z常见的液滴生成需求主要特点：（1）高达10000个/秒（2）液体流量：0.1 μL/min到5 mL/min（3）液滴尺寸分散：0.3%（4）液滴含量的变化：100 ms参考文献[1] Christopher, G. F., and S. L. Anna. “Microfluidic methods for generating continuous droplet streams.” Journal of Physics D: Applied Physics 40.19 (2007): R319.[2] T. Thorsen, R.W. Roberts, F.H. Arnold et S.R. Quake : Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Physical Review Letters, 86(18):4163–4166, 2001.[3] Dreyfus, R., Tabeling, P., & Willaime, H. 2003. Ordered and disordered patterns in two-phase flow in microfluidics. Physical review letters, 90, 144505–144507.[4] Tice, J.D., Lyon, A.D., & Ismagilov, R.F. 2004. Effects of viscosity on droplet formation and mixing in microfluidic channels. Analytica chimica acta, 507, 73– 77.[5] Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., & Whitesides, G. M. (2006). Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction scaling and mechanism of break-up. Lab on a Chip, 6(3), 437-446.[6] T. Cubaud and T. G. Mason, “Capillary threads and viscous droplets in square microchannels,” Physics of Fluids, vol. 20, p. 053302, 2008.[7] A. M. Ganan-Calvo and J. M. Gordillo, 2001. “Perfectly monodisperse microbubbling by capillary flow focusing,” Physical Review Letters, vol. 87, p. 274501[8] Anna, S. L., Bontoux, N., and Stone, H. A. 2003. “Formation of dispersions using “flow focusing” in microchannels”. Applied Physics Letters, 82(3) :364–366.[9] J. Tan, J.H. Xu, S.W. Li et G.S. Luo, 2008. “Drop dispenser in a cross-junction microfluidic device : Scaling and mechanism of break-up”. Chemical Engineering Journal, 136(2- 3):306–311[10] L. Yobas, S. Martens, W.-L. Ong, and N. Ranganathan, 2006. “High–performance flow–focusing geometry for spontaneous generation of monodispersed droplets,” Lab on Chip, vol. 6, pp. 1073–1079[11] Abate, A. R., Poitzsch, A., Hwang, Y., Lee, J., Czerwinska, J., and Weitz, D. A. 2009. “Impact of inlet channel geometry on microfluidic drop formation”. Phys. Rev. E, 80(2) :026310.[12] Utada, A. S., Fernandez-Nieves, A., Stone, H. A., and Weitz, D. A. 2007. “Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams”. Phys. Rev. Lett., 99(9) :094502.[13] S.L. Anna et H.C. Mayer, 2006. “Microscale tipstreaming in a microfluidic flow focusing device”. Physics of Fluids, 18(12):121512[14] L. Peng, M. Yang, S.-S. Guo, W. Liu et X.-Z. Zhao, 2011. “The effect of interfacial tension on droplet formation in flow-focusing microfluidic device.” Biomedical Microdevices, 13 (3):559–564[15] P. B. Umbanhowar, V. Prasad, and D. A. Weitz, 2000. “Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream,” Langmuir, vol. 16, pp. 347–351[16] C. Cramer, P. Fischer, and E. J. Windhab, 2004. “Drop formation in a co–flowing ambient fluid,” Chemical Engineering Science, vol. 59, pp. 3045–3058[17] Y. Hong and F. Wang, 2007. “Flow rate effect on droplet control in a co-flowing microfluidic device,” Microfluidics and Nanofluidics, vol. 3, pp. 341–346[18] R. Xiong, M. Bai, and J. Chung, 2007. “Formation of bubbles in a simple co–flowing microchannel,” Journal of Micromechanics and Microengineering, vol. 17, pp. 1002–1011,[19] G. I. Taylor, “The formation of emulsions in definable fields of flow, 1934. ” Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Containing Papers of a Mathematical and Physical Character, vol. 146 (858), pp. 501–523[20] Suryo R and Basaran O A 2006 Phys. Fluids 18 082102
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- 网络研讨会：微流控乳液滴(W/O/W和W/O)中的细胞包裹
微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。
本次网络研讨会介绍了微流控液滴（W/O/W和W/O）包裹细胞研究结果，结果表明微流控液滴技术可以提高单分散液滴的包裹效率；液滴中的细胞提高了W/O液滴的稳定性；相比于W/O液滴，W/O/W的细胞包裹提高了细菌活性；此外，介绍了细菌释放的详细机制可以通过微流体产生的单分散液滴来研究。
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- 用于片上生物工厂的基于液滴微流控的集成分散相显微镜
2% surfactants表面活性剂FluoSurf
In the droplet generation unit, highly monodisperse droplets encapsulating H. lacustris cells are generated on demand. The buffer with suspended H. lacustris cells and biocompatible fluorescence oil (HFE-7500) with 2% surfactants (FluoSurf, Emulseo) are employed as the dispersed phase and the continuous phase, respectively.
用于片上生物工厂的基于液滴微流控的集成分散相显微镜
在代谢工程中，对单细胞胞内结构的生物分子成像以及随后的细胞筛选有很高的要求，以开发具有所需表型的菌株。 然而，当前方法的能力仅限于群体规模的细胞表型鉴定。 为了应对这一挑战，我们建议利用分散相显微镜与基于液滴的微流体系统相结合，该系统结合了液滴按需生成、生物分子成像和液滴按需分选，以实现细胞的高通量筛选 已识别的表型。 特别是，细胞被封装在形成微流体液滴的均质环境中，并且可以研究生物分子诱导的分散相以指示单个细胞中特定代谢物的生物量。 因此，检索到的生物量信息引导片上液滴分选单元筛选具有所需表型的细胞。 为了证明概念，我们通过促进湖红球藻菌株向高产天然抗氧化剂虾青素的进化来展示该方法。 所提出的系统具有片上单细胞成像和液滴操作功能的验证揭示了高通量单细胞表型分析和选择潜力，适用于许多其他生物工厂场景，例如生物燃料生产、细胞治疗中的关键质量属性控制等。本内容节选自下面文献：
Yingdong Luo, Yuanyuan Huang, Yani Li, Xiudong Duan, Yongguang Jiang, Cong Wang, Jiakun Fang,* Lei Xi,* Nam-Trung Nguyen and Chaolong Song, Dispersive phase microscopy incorporated with droplet-based microfluidics for biofactory-on-a-chip, Lab Chip, 2023,23, 2766-2777. DOI: 10.1039/D3LC00127J
- 抗体ZL和高通量筛选中的单细胞包覆的液滴微流控实验
- 液滴微流控和单细胞包覆为抗体ZL中的发现提供了关键。本文着重于充分挖掘天然B细胞多样性以快速从人类患者中分离抗原特异性抗体的应用。人抗体库确实越来越被认为是ZL级抗体的有价值来源。然而，用于开发表达反抗体表达的B细胞的方法在其快速分离稀有和抗原特异性结合物的能力方面受到限制。如下ZD介绍了将200万个初级B细胞封装到皮升大小液滴的微流体技术，其中同源V基因在液滴内融合形成scF-v盒文库。使用液滴微流控进行单细胞包覆实验方法
该方法包括将单个B细胞包裹到体积为400μL的油包水液滴里面。玻璃芯片的入口有2个，允许2种液滴试剂通入到芯片的通道内。OB1压力控制器用来产生高速率且稳定可靠的尺寸均匀的液滴。将细胞水溶液和RT-PCR混合物各自在30mbar下泵送，同时将HFE7500氟化油+2%w/v008-氟表面活性剂在67mbar下泵送，通过调节OB1压力控制器的输出压力以获得1:1的水性混合物流体。这样做，可以在40分钟内常规封装100万个B细胞。微流体芯片的结构设计用于合并两种含水流体流：一种携带B细胞悬浮液，另一种含有RT-PCR混合物。将所得乳液收集在PCR条带管中并用40μL的矿物油覆盖。除去过量的氟化油，以保持总体积约为100μL。
实验装置
用到的仪器
Elveflow压力和流量控制器（OB1 MK3）样品储液池（小型、中型和大型），每个培养基样品对应一个样品储液池。玻璃芯片
单细胞包覆的实验装置图
实验结果
从康复期供体中纯化分离的B细胞，并用RT-PCR试剂包封入油包水液滴中，使得同源VH和VL结构域被扩增和连接。得到的RT-PCR扩增子形成表达准备的scFv，其可以直接表达用于筛选，在噬菌体上展示用于选择，并且用于谱系表征的深度测序。
在40分钟内可以常规封装100万个B细胞。滴定B细胞悬浮液以使每10个液滴达到~1个细胞，基于泊松统计，将导致单细胞包覆的概率>95%。
在此，包覆液滴的细胞收集到μ-Slide通道载玻片（Ibidi）中并以200×放大率成像。将细胞用CellTracker Red和Green染料染色，混合，并以有利于单细胞包覆的密度包覆到液滴里面。每个液滴形成一个独立的反应器，其中细胞的同源V基因可以被扩增和配对。
结论
用于单细胞包覆的液滴微流控允许从数百万初级B细胞快速捕获天然库，因此能够实现功能强大且灵敏的筛选平台，对ZL性抗体开发、免疫谱表征具有重要意义，并且可在合理的疫苗设计中具有广泛的应用。
这里概述的过程是从自然库中发现抗体Z快的过程之一。一名研究人员可在4周内从数百万初级B细胞迅速发展为特异性单克隆抗体。
这一过程可能是对抗新出现的传染定的宝贵工具，例如Z近爆发的埃博拉病毒和寨卡病毒。法国Elveflow微流控OB1压力控制器进行液滴微流控包覆单细胞的优势（1）<1% CV单分散性
确保wan美控制的液滴尺寸
（2）较低的试剂成本和分析时间
40ms建立时间：在启动系统时，短的建立时间可以降低昂对样品的损失。
（3）高通量包覆
筛选适用于数据收集的大范围的理想数据集合的变量
（4）工作流程自动化
创建自己的控制序列并让其自动流动该类液滴包覆细胞的参考论文Saravanan Rajan, Michael R. Kierny, Partha S. Chowdhury, et al., Recombinant human B cell repertoires enable screening for rare, specific, and natively paired antibodies, 2018, Nature Communication Biology, DOI: 10.1038/s42003-017-0006-2.
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- 网络课堂：基于液滴的微流体技术介绍
微流控液滴技术是近年来在微流控芯片上发展起来的一种研究几微米至几百微米尺度范围内微液滴的生成、操控及应用的新技术。微液滴常作为微反应器，实现生化反应、试剂快速混合以及微颗粒合成等，极大地强化了微流控芯片的低消耗、自动化和高通量等优点。本次网络课堂主要介绍了液滴微流控的发展历程、微液滴产生方式、液滴微流控的应用领域、液滴产生的实验装置、双乳液滴产生实验等知识。
- 基于纳米微滴的试剂注入到油包水液滴中
FluoSurf (2%, w/w) in HFE 7500 含氟表面活性剂
Zhu B, Du Z, Dai Y, Kitguchi T, Behrens S, Seelig B. Nanodroplet-based reagent delivery into water-in-fluorinated-oil droplets. ChemRxiv. Cambridge: Cambridge Open Engage; 2023;
体外区隔化是一种生成油包水微滴的技术，用于建立基因型(DNA信息)-表型(生物分子功能)连锁，这是许多生物学应用所需要的。近年来，由于氟化油具有较好的生物相容性，在微滴制造中得到了越来越广泛的应用。然而，需要在含氟水的油微滴中添加试剂来进行多步反应是困难的。芯片上的微滴操作通常用于此目的，但它可能遇到一些技术问题，即低通量或将试剂递送到不同的微滴中有时间延迟。因此，我们评估了采用基于纳米液滴的方法使用铜离子和中等大小的肽(2 kDa)分子来解决这些问题的可行性。
- 数字微流控芯片控制微液滴主要有哪几种方式
- 数字微流控芯片控制微液滴主要有哪几种方式
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