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　　您是否正在计划进行活细胞成像实验？您想以最高质量获得令人惊叹的延时图像吗？新的ibidi Stage Top Incubators – Silver Line活细胞工作站是您的理想解决方案。

　　优势：

　　Universal Fit：易于安装在倒置显微镜上

　　出色的成像：带有xyz稳定性的高端显微镜

　　精确控制：由于改进的动态湿度调节，无蒸发或冷凝

　　由德国设计和制造

　　物镜加热器 Objective Heater

　　防止样品冷却：在高分辨率活细胞成像期间（例如，使用油或水浸泡）保持样品确定和稳定的温度

　　技术特点：

　　具有可控的温度、湿度、CO2/O2 ，用于倒置显微镜上进行长期活细胞成像的stage top孵育系统

　　易于安装在每个带有多孔板支架的倒置显微镜上

　　由于连续电流的热调节（最小温度/z-position波动），显微成像期间的最高聚焦稳定性

　　由于加热板的夹紧机构，显微镜载物台上的xy稳定性最高

　　通过动态、湿度控制的反馈调节（ibidi 的专利湿度控制）以及在样品旁进行的精确测量（集成在加热盖中湿度传感器）来防止在 Incubation Chamber内蒸发

　　还提供用于缺氧和耗氧实验的 CO2和 O2控制：ibidi Stage Top Incubator Slide/Dish, CO2 /O2 – Silver Line

　　由于最佳的热量分布，在Incubation Chamber的加热盖上无干扰冷凝的精美图像

　　与ibidi Objective Heater Universal（需另购）一起使用时，适用于高分辨率油浸显微镜

　　适用于微分干涉对比 (DIC) 显微镜和 TIRF

　　含带leveling option的载玻片支架，可用于腔室载玻片、通道载玻片和盖玻片，以及所有 ibidi µ-Slides（详见操作说明）

　　含带leveling option的培养皿支架，可用于具有不同壁高的35 mm dishes培养皿，µ-Dish 35mm，high 和µ-Dish 35mm, Low

　　含外部温度传感器（如：用于在系统校准期间测量样品的温度）

　　准确稳定的CO2和O2气体孵育

　　使用加压气体产生气流（无振动）

　　提供可选的气压发生器（当无法获得加压空气时）

　　减少电缆数量，易于操作

　　含用于远程控制和数据记录的 IncuControl 软件

　　应用：

　　1、 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line加热孵育系统非常适合需要显微镜生理条件的活细胞成像实验。

　　结合ibidi气体控制系统和ibidi加热系统，可以精准控制显微镜上的温度、湿度和CO2/O2水平等基本参数，以获得可重复的结果，比如：

　　趋化性实验

　　血管生成实验

　　细胞迁移实验

　　伤口愈合实验

　　增殖实验

　　流动检测下的细胞培养

　　缺氧和耗氧实验（仅限ibidi Stage Top Incubator Slide/Dish，CO2 /O2 – Silver Line）

　　2、 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line加热孵育系统针对需要额外聚焦稳定性的高分辨率成像应用进行了优化，比如：

　　TIRF

　　荧光显微镜

　　共聚焦显微镜

　　DIC显微镜

　　油浸显微镜

　　ibidi Stage Top Incubators – Silver Line 加热孵育系统工作原理

　　细胞对环境的变化做出敏感的反应。温度、湿度/蒸发和 CO2 /O2水平等因素显着影响细胞培养实验的结果。因此，在活细胞成像实验期间保持显微镜载物台上的最佳条件以实现生物学相关和可重复的结果至关重要。

　　 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line 加热孵育系统结合了ibidi Heating System – Silver Line加热系统和 ibidi Gas Incubation System – Silver Line气体控制系统。

　　ibidi加热系统为高分辨率活细胞显微镜创造稳定和均匀的温度。适用于多孔板的通用安装框架的倒置显微镜载物台。当放置在ibidi加热Chamber中时，在显微镜上进行活细胞成像实验期间，细胞培养容器将保持稳定、确定的温度。

　　ibidi气体控制系统为像ibidi加热系统的stage top孵育系统提供湿润且富含CO2的空气。气体混合物通过stage top孵育系统连续冲洗，确保碳酸氢盐缓冲液的最大湿度和最佳pH值。

　　对于缺氧实验， ibidi Stage Top Incubators, CO2/O2 – Silver Line加热孵育系统可以精确控制细胞培养容器中的氧气水平。周围O2水平可以控制在1%~21%的范围内，很容易适应实验要求。

　　订购信息：

　　细胞生物学是生命科学的一门学科。顾名思义，它致力于研究生物。单凭这一事实就足以成为研究细胞自然生存状态的理由。当然，活细胞成像还有其他深层次的原因。在本篇文章中，我们列举了用延时显微镜研究活细胞是有意义的五大很好的理由。

　　背景

　　活细胞成像允许在一定时间内在显微镜下对细胞进行体内观察。各种显微镜技术适用于活细胞成像：例如，可以采用无标记的技术，如相差，DIC，或干涉测量法，也可以依靠荧光显微镜，利用荧光标记标记和可视化细胞亚结构、分子或蛋白质。当然，活细胞成像也面临挑战，在建立活细胞图像实验时需要考虑某些要求。最重要的是，必须确保显微镜配备了一个stage top 培养箱，能够提供理想的环境，使细胞在一段时间内保持存活和健康。

图1.A：活细胞成像过程中需要考虑和控制的环境参数

图1.B：倒置显微镜的台顶培养箱示意图

　　参数和环境条件是此类实验的重要部分，我们将在以后的公众号中讨论。如果您有兴趣，可以在本篇文章中查看更多相关内容。在此我们已经介绍了基本知识，接下来我们将继续深入探讨为什么您应该使用活细胞成像来研究您的细胞：

　　1.避免固定过程中的人工制品

　　细胞通常在显微镜观察前固定（如免疫荧光），以保存在逼真的状态。多年来，许多不同的化学和物理程序已被优化和建立，以保持原始样品的质量。然而，固定过程会对细胞造成损害（当然在这个过程之后，它们会死亡），并不可逆转地改变其组织、结构和形态（细胞器收缩、蛋白质定位错误等）。然而，活细胞成像可以让我们研究活细胞。这意味着他们应该展示他们的自然形态，这仍然会受到荧光标签、激光等的影响，但这就像环境条件一样，是一个不同的状况。

　　2.观察和分析动态过程

　　活细胞成像使我们能够观察整个细胞群、单个细胞甚至亚细胞水平的动态事件。当固定细胞将其锁定在特定时间点的特定（行为或结构）状态时，对活细胞的显微镜观察可以洞察整个动态过程。基于功能性细胞的检测，如损伤和迁移（图2）或趋化实验是活细胞成像应用的很好的例子。这些分析使得研究细胞对化学（趋化性）或机械（伤口愈合）刺激的反应成为可能。

图2：使用ibidi Stage Top孵育系统的活细胞成像显示了伤口愈合和迁移试验中MCF7细胞的间隙闭合。相差；10倍物镜。

　　3.实时跟踪细胞变化

　　活细胞显微镜是实时了解细胞随时空变化的一种有价值的方法，而不是依赖于固定细胞的端点的分析结果。通过使用延时视频显微镜对细胞进行更长时间的跟踪，可以捕捉到结构重排的动态(如图3，感受趋化刺激后细胞骨架的极化), 或使用固定细胞可能会错过的瞬时细胞性活动(如，有丝分裂期间的染色体分离)。

图3：应用趋化梯度后，表达LifeAct的原代树突状小鼠细胞中肌动蛋白动力学的活细胞成像

　　4. 研究单分子动力学、定位和相互作用

　　先进荧光标记和成像技术的发展，如光脱色荧光恢复技术（FRAP）、荧光寿命成像显微技术（FLIM）和荧光共振能量转移技术（FRET），使活细胞成像过程中单分子定位、动力学和相互作用的观察和分析成为可能。

　　FRAP可以测量活细胞内荧光标记分子和蛋白质的迁移率。FLIM通过测量附着的荧光团的寿命来提供有关细胞分子分布及其环境的信息。

　　利用FRET，人们可以通过检测两个分子在纳米级相互接近时所附荧光团的相互作用来测量活细胞中两个分子的直接相互作用。

　　5. 从单个实验中获取更多信息

　　总的来说，如果您进行活细胞成像，您可以从单个实验中获得比从固定细胞成像更多的信息。这是因为活细胞成像使人们能够跟踪分子动力学和动力学，并提供了您感兴趣的一个更大、更全面的细胞过程图像。

　　对固定样本的分析通常只提供某个细胞性活动的快照，而跟踪整个动态过程使人们能够从单个实验中测量更多参数，并得出更多不同的结论。

　　如您有兴趣了解更多关于活细胞成像的知识，请关注我们公众号活细胞成像应用相关内容。也可以向我们索要相关资料。

　　活细胞成像应用相关内容：

了解复杂且快速变化的细胞动力学是深入探索生物进程的重要一步。因此，现代生命科学研究越来越需要关注于在分子水平上实时发生的生理事件。
 
 
观察和分析活细胞时面临的挑战
在固定细胞或组织中，获取样品“分子状态”的信息已是一项艰巨的任务。如果需要获取实时信息，，就必须尽可能在实验过程中保证细胞自然地运行生理机制，因此将加大实验的困难程度。此外，由于很多生理过程的持续时间仅有几秒甚至几毫秒（例如细胞内离子水平的变化），必须在相对较短的时间内采集大量信息。
满足这些挑战性需求的一种方法是采用被统称为活细胞成像的光学技术。活细胞成像可研究活细胞中的实时动态生理过程，而非提供细胞当前状态的一幅“快照”。它把快照转变成了电影。活细胞成像可提供单个细胞、细胞内网络（原位）甚至整个生物体（体内）中动态发生分子事件的空间和时间信息。这些特性让活细胞成像成为了研究细胞生物学、癌症、发育生物学和神经科学中动态生理过程的必要技术。
近年来，电子学、光学和生物化学的迅速发展，使得科学家们更轻松的实现活细胞成像。如今的活细胞成像方法使用优化的显微镜、专用光源、高速相机、高灵敏度探测器和特异性的荧光标记物，可同时提供技术成熟且仍具有创新性的全套解决方案，满足在分子水平上对单细胞或整个细胞网络进行实时研究的挑战性需求。
使用线粒体标记物(MitoRed®)和荧光钙染料(Fluo-4)对细胞进行活细胞成像
 
图1：荧光钙染料Fluo-4标记的睾丸支持细胞的原代培养。钙染料的位置类似于表征细胞内的钙分布。
 
图2：线粒体标记物MitoRed®染色的睾丸支持细胞的原代培养。
 
图3：图1和图2的叠加。观察钙斑和线粒体的共定位情况。
 
图4：睾丸支持细胞的DIC图像。
 
使用共聚焦显微镜Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像软件获取的图像。由德国亚琛工业大学生物II研究所化学感知系Sophie Veitinger博士提供。（地址：德国马尔堡菲利普斯大学细胞生物学和细胞病理学研究所）
对应刊物（非图片来源）：
 
活细胞成像中的常见问题
活细胞成像通常适用于培养的细胞系（例如HEK细胞、HeLa细胞）、原代细胞（例如皮肤细胞、神经细胞）、急性制备的组织切片（例如脑切片）或整个器官或生物体。因为细胞被带出其原本“自然”的培养环境并会受到光毒性的影响，所以在实验过程中的首要任务是保持细胞的健康状态。
 
细胞外溶液
不同类型的人工细胞外溶液（林格氏液、人工脑脊液(ACSF)）和培养基（例如Leibovitz L-15）用于为细胞提供维持其生理功能所必需离子和其他辅助因子。用于活细胞成像的培养基成分包括从极简单的“含盐”溶液（例如林格氏液）到非常复杂的混合物（例如Leibovitz L-15），种类繁多。
但所有溶液都有一个共同点，即都包含pH缓冲液，因为暴露在环境中之后，会显著改变培养的pH（通常pH 7.2.-7.4）。在很多细胞外溶液中，pH缓冲液通过添加10–20 mM两性离子有机化学品HEPES（2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸）来实现。但对于很多细胞来说，细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲液（例如MOPS、TES），因为培养基中缺乏pH缓冲碳酸氢盐会对细胞造成伤害。要解决该问题，必须将二氧化碳输送到细胞外溶液中（二氧化碳与细胞外溶液接触时，会转化为碳酸氢盐）。这可以通过两种方式实现：一种是不断输送气态二氧化碳（通常以碳化物的形式：95%的氧气和5%的二氧化碳）到细胞外溶液中，并不断对细胞进行换液。这种方法通常用于代谢周转率高于细胞增殖的切片制备。
另一种常见的方法是将细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。在此类培养物中持续供应5-7%的二氧化碳气体，并且可以严格控制温度。必须根据使用的样品类型和实验的持续时间，来确定化学缓冲的细胞外溶液是否足以使细胞保持良好状态，或者是否需要输送二氧化碳甚至使用培养小室。在很多情况下，化学缓冲溶液即可满足细胞培养和短时实验的要求。，因为急性切片代谢周转率要高得多，通常需要足够的二氧化碳供应。但对于很多细胞类型和长时间成像实验，必须使用培养小室。
 
光毒性
使用荧光染料进行活细胞成像的另一个问题是：激光或高强度电弧放电灯的入射光会损害细胞，即所谓的光毒性。光毒性主要在合成荧光染料被激发时发生。荧光染料被激发后，它们将与分子氧发生反应并产生自由基。为避免光毒性，必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间，以将入射高能光剂量保持在尽可能低的水平。在实验设计过程中，还必须考虑实验的持续时间。长时间实验中，通常不需要高帧速率。因此，图像采集的周期频率通常可以从例如每秒10多帧降低到每秒1帧甚至更低。这将显著降低样品上的入射光剂量，从而大幅降低光毒性。
对于低强度荧光信号成像，可以考虑更改图像采集条件设置，比如在大多数情况下，通过将相机功能用作像素合并或提高增益，甚至使用特殊的高灵敏度相机（例如EM-CCD相机）进行成像。这样可以在不增加激发持续时间或光强度的情况下实现更好的信噪比和信号质量，而这两者都会导致更高的光毒性。此外，选择具有长激发波长的荧光基团也可降低光毒性，因为与具有短激发波长的荧光基团相比，传递给样品的能量更低。荧光蛋白（例如绿色荧光蛋白(GFP)）的光敏位点位于被多肽包膜覆盖的蛋白质内部，因此通常没有光毒性。
 
焦面漂移
此外，在长时间的活细胞成像实验中，很可能发生焦面漂移的问题，，。可以使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。
 
图5：接种了豇豆花叶病毒(CPMV)的豇豆初生叶(Vigna unguiculata "California Blackeye")，在病毒RNA 2中的运动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CP)之间的插入GFP基因。GFP以游离蛋白的形式大量表达（因此未融合于MP或CP），并且可以定位在受感染的表皮和叶肉细胞的细胞质和细胞核中。由荷兰瓦赫宁根农业大学，生物分子科学部门分子生物学实验室的Joan Wellink博士及植物科学部门病毒学实验室的Jan van Lent博士提供。
 
 
视频1：用DIOC6染色的活洋葱球细胞，同时进行透射光检测；使用共聚焦显微镜Leica TCS SP2 AOBS RS拍摄，63倍物镜，1.5倍变焦，2倍线平均，扫描分辨率512 x 265，速度每秒4.7帧。
 
视频2：用表达GFP融合蛋白的构建体瞬时转染的COS细胞。细胞溶质蛋白在细胞中呈针状分布。3D堆栈(10.14 µm，14层切)每5秒记录一次，，持续10分钟。本视频使用了堆栈的最大投影。512 x 512像素，双向扫描，变焦2倍，物镜HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法国伊尔基希细胞生物学研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用于活细胞成像的方法
可应用于活细胞成像的宽场和共聚焦显微技术的范围也非常广泛。通常，使用复式显微镜和反差对比方法（例如相差和微分干涉相差（DIC）），随时间观察细胞的生长、聚集或运动过程。此外，通常使用体视显微镜或宏观镜对大型标本（例如发育中的斑马鱼胚胎）进行延时成像。在过去数十年中，先进荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜应用的迅速增加，使生物研究的视角从平面向三维立体转变。
阅读有关活细胞成像技术的更多信息
活细胞成像技术——观察生命的分子水平动态
 
相关链接：细胞生物学、 细胞培养、活细胞成像、类器官和3D细胞培养

了解更多：https://www.leica-microsystems.com.cn/cn/?nlc=20201230-SFDC-011237

•  什么是活细胞成像？  

活细胞成像(live cell imaging)统称为捕捉活的、活动状态的细胞图像的技术，这些细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。相应地，活细胞成像的应用可以分为两大类：

❶ 细胞在自然状态下的图像记录。

❷ 实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程。

•  观察分析活细胞时面临的挑战  

▷ 在相对较短的时间内采集大量信息。

▷ 要保持细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。

▷ 激发光源会损害活细胞。

▷ 细胞焦面漂移，无法聚焦。

▷ 需要使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。

Revolution全自动显微镜成像系统

Revolution全自动显微镜成像系统部件高度集成内置，节省空间，避免繁琐调试及维护；触屏式操控观察工作站，界面直观简洁，易于学习，方便使用。Revolution全自动显微镜成像系统的光源采用高能LED光源，自动荧光切换把光毒降低。

▌智能化全自动多功能系统：

▶ TimeLapse延时摄影：可以根据设定在特定时间内完成特定间隔时间和特定的拍照张数。

▶ 独有的Hyperscan快速成像：30帧高速成像，可以在几秒钟内完成上百张照片的采集。

▶ Multi-well Point孔板导航成像：不限定孔位大小，只需输入参数就可以自动完成多孔或单孔采集。

▶ Focus Map自定义多点聚焦：可以自动完成不同层面的自动聚焦。

▶ Z-Stacking多层扫描大景深成像：完成多层面大景深成像。

▶ DHR智能实时数字化降噪：实时完成反卷积计算，得到清晰图像。

▌ECHO INCUBATOR为活细胞观察提供一个稳定而灵活的培养环境

ECHO INCUBATOR采用紧凑的一体式设计，方便用户快速安装和拆卸。箱体结构透明和大型前置开门设计，可为用户提供清晰的观察视野并方便操作样本。采用无风扇对流加热和循环热空气方案，在消除振动的同时并可防止外部灰尘进入您的样品和仪器光学元件。提供稳定的细胞生长环境，确保适合的细胞培养条件，使细胞处于zuijia生长状态。

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

ADHERENT MAMMALIAN CELLS

YEASTS

WORM EMBRYOS

作为细胞成像领域的lingxian者，PerkinElmer 推出Z新的成像和分析软件平台；用户通过该平台的全新测量功能可以更好地理解细胞间和细胞内的关系

马萨诸塞沃尔瑟姆 - 2011 年 9 月 28 日 专注于提高人类及其生存环境的健康与安全的lingxian者 PerkinElmer, Inc.今天宣布发布Volocity 6.0，这是该公司 3D 细胞成像软件的Z新版本。

Volocity 软件具有一系列高性能的工具，可以用于探索、交互和发布来自细胞、组织和器官的 3D 成像数据，以及这些细胞、组织和器官随着时间的推移出现的行为变化，从而更深入地了解和研究细胞的相互作用。该软件是一款通用的解决方案。通过它提供的各种重要功能，用户可以查看、分析和验证使用各种共聚焦显微镜以及宽视野和高内涵筛选系统采集的 3D 荧光图像，而且该软件是完全集成的，您将感受到无缝的用户体验。

“PerkinElmer 致力于支持Z终将在诸如癌症和神经退行性疾病等疾病研究领域产生新疗法的各种新研究。”PerkinElmer 生物研发业务成像和检测解决方案副总裁 Achim von Leoprechting 说。“凭借新应用和增强的成像功能，新款 Volocity 6.0 软件将帮助科学家更好地理解疾病如何影响细胞以及潜在疗法如何影响疾病细胞和健康细胞。”

除了简单的细胞之外，Volocity 软件还可以根据生物学分类（如细胞核、细胞膜、细胞器和蛋白质）组织和关联测量，从而更加简单快速地执行分析和理解结果。此外，全新的界面能够使各种技术水平的用户执行复杂而富有挑战性的生物测量，将 3D 分析功能的应用范围扩展到更加广泛的潜在用户群体。

利用 Volocity 6.0 套件重要的新功能，用户可以：

关于 PerkinElmer, Inc.

PerkinElmer, Inc. 是一家专注于提高人类健康及其生存环境安全的lingxian公司。据报道，该公司 2010 年收入约为 17 亿美元，拥有约 6,200 名员工，为超过 150 个国家/地区的客户提供服务，同时该公司也是标准普尔 500 指数的成员。有关其它信息，请通过1-877-PKI-NYSE, 或访问 http://www.perkinelmer.com.cn/?tum_source=instrumentDotComNews&utm_campaign=Volocity6_Bio_2011CN。

Edelman（代表 PerkinElmer, Inc.）
Amanda L. Connolly
直拨电话：+1-404-832-6785
amanda.connolly@edelman.com

来源: PerkinElmer, Inc.

新闻由 Acquire Media 提供

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

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不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

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4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

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 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

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开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

7的图片

8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

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使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

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MICA

研究人员在活细胞成像技术的帮助下，可以深入了解活细胞甚至完整生物体的动态过程，这包括细胞内和细胞外活动。一些代表性的示例包括蛋白质或脂质转运、免疫细胞迁移，类器官的组织结构等。活细胞成像要求样本和显微镜系统具备特定的属性。在这篇文章中，我们描述了MICA如何解决活细胞成像的问题，并提供了合适的示例。

活细胞成像

活细胞成像在微观层面揭示了生物体变化的全过程。它要求将样本保存在接近生理的条件下。我们会在后面重 点介绍到。典型的样本包括活细胞培养、活组织、类器官或模式生物，通常会使用荧光显微镜研究这类样本。为此需要转染细胞，从而产生表达荧光标记蛋白质的转基因体。此外，还可以使用活细胞染料。

挑战

环境条件

为尽可能获得接近真实状态的实验结果，活细胞成像条件必须模拟生理环境。不同的生物体所需的生理条件也不同，包括温度、pH、氧气含量等。例如，哺乳动物细胞要求的温度是37°C左右，昆虫细胞的最 佳温度是27°C，鱼为28°C，而裂殖酵母则为30°C左右。

在碳酸氢钠缓冲液的帮助下，细胞培养基内的pH值持续保持在7.0-7.4，这就要求培养箱环境中相应地存在二氧化碳。此外，培养箱的环境应该是水饱和的，这样就不会有培养基蒸发了。

体内不同组织和细胞的所需氧含量是不同。目前细胞培养箱和活细胞成像并没有广泛考虑氧的问题。不理想的氧气水平会导致增殖率下降（高氧）或代谢率降低（低氧）（Hadanny, A.; Efrati, S.）。

光保护是活细胞成像的另一个挑战，因为光照射可以影响活细胞本身以及荧光团。例如，强光可以导致DNA损伤或光漂白荧光团。

MICA的设计旨在应对所有这些挑战

外壳本身就像一个培养箱。这意味着样本周围空间被加热到所需的温度（比室温高5°C，最 高42°C），并平衡到所需的二氧化碳浓度和湿度。

如果需要的话，氧气浓度可以进行调节。所有的参数均可通过MICA LAS X软件控制。样本的光照射条件由OneTouch功能设置，并可通过“Sample Protection – Image Quality”滑块进行调整，以平衡所需的信号量与保护活细胞和荧光团。

为了在最 小的环境干扰下获取样本，在前门中隐藏有一个小的服务挡板。

图1：MICA是一个培养箱。盖子下面的整个空间可以被平衡到所需的温度、湿度和二氧化碳浓度。为了快速检查样本或操作，前盖可以折叠下来，一个小的服务挡板可以滑开。

光可能是有毒的

由于光对样本有负面的影响，任何光都可能干扰细胞内的分子，例如紫外线可能伤害皮肤。此外，荧光团可能形成与分子相互作用的自由基。光的负面作用被称为光毒性。挑战在于激发产生足够的信号来解答科学问题的光强与尽量减少光毒性的平衡。MICA通过提供一个工具来帮助用户在不需要了解技术背景的情况下精确地平衡这两件事——“Sample Protection – Image Quality”滑块。只需点击一下，OneTouch将根据滑块上的选择设置所有的激发和检测参数。

细胞内的动态变化可能非常快。例如，细胞器或囊泡分子的运动速度可达几微米/秒（Alberts B.等人）。这极大程度的考验了对图像采集的要求，特别是当需要对多个荧光团进行成像时。这里的问题是，生物不会暂停所有的荧光通道从而在相同的状态下进行采集，而是持续不断进行。在一个经典的基于荧光滤片的系统中，通常最耗时的步骤是为不同的通道更换滤光片。这导致实验中两个荧光团在两个不同的时间点被监测，导致无法实现精确的时空相关性。

MICA FluoSync™技术使用户能够同时获得多达四个荧光通道。这意味着不同的囊泡、细胞骨架和运动蛋白可以以100%的时空相关性进行成像。此外，同步采集使成像时间点的节奏更快，因此，可以用更灵敏地记录快速的细胞运动。

在给定的时间范围内记录更多的时间点信息

在一个实验中记录更多的时间点信息可能是一个挑战。假设用户想每10分钟记录一次，那么在下一个周期开始之前，只能记录一定数量的位置。通常情况下，如果您想在同一位置记录多个标签，就会有更多限制，但MICA不存在这个问题。FluoSync™技术使用户能够以四倍的速度记录，因为它最 多可以同时获取四个标签，从而为用户留下更多的时间来记录更多位置。用户不必再在标签数量和位置之间进行权衡。

寻找正确的位置进行成像

寻找正确的样本位置和设置实验是具有挑战性的。实验人员需要使用目镜了解样本的整体概况，并记住不同的位置。一些显微镜可以生成样本的预览，这可以提供一些帮助，但实验人员仍然需要指出图像中要进一步成像的位置。MICA的Navigator工具可简化这一过程。用户可以生成低放大倍数或高放大倍数的预览，轻松定位感兴趣的区域，这些感兴趣区域可以用工具直接在图像上标记出。通过这种方式，后续高分辨率的图像可以保存下来。

选择正确的活细胞成像物镜

由于活细胞成像通常是在水溶液中进行的，高倍率物镜通常使用水作为浸没介质，因为它与培养基介质的光学特性相匹配。将水手动放在物镜和样品之间是很麻烦的，而且会导致样本的焦点和位置的改变。此外，水蒸发得相当快，需要不断补充。MICA集反馈回路于一体，在水浸式物镜的整个使用过程中，首先建立并维持浸没状态。这种方法不需要手动操作，可以进行长期实验。

为进一步提高光学质量，一些物镜会通过校正环来补偿样本平板的厚度。校正环可手动、也可自动操作。MICA配置了自动校正环功能，可实现自动优化。

重复实验之间的可比性

科学实验的一个关键方面是，尽可能少的变更可变参数以实现对样品和结果影响的把控。这包括在所有的实验中应用同一套成像条件。一个方面是稳定的环境条件（温度、pH值和O2，见上文）。另一个重要方面是相同的成像参数（激发和检测）。MICA默认在不同项目中保持成像参数不变，用户仅基于自己的需求进行调整。可根据参考图像恢复成像参数。在环境条件方面，MICA是一个培养箱。MICA条件稳定能允许MDCK囊肿连续生长3周（见下文）。

方法

MICA有用于活细胞成像的特殊的样本夹。这包括用于小型（36毫米）和中型（60毫米）培养皿的支架。

图2：活细胞成像样本架。有适用于不同尺寸的培养皿的支架。活细胞成像也可以使用经典的载玻片支架（未显示），例如，使用ibidi µ-Slide 8 Well载玻片支架。

囊泡

U2OS细胞同时用WGA-Alexa488和WGA-Alexa555进行染色。这两种染料都聚集在细胞的质膜和所有囊泡和内体上。荧光剂同时或序列成像以进行比较。环境被设定为37℃恒温和5%CO2，即生理pH水平。

对于高倍率成像，使用了带有自动加水功能的63x/1.20水镜。

斑马鱼

发育中的胚胎从球期到体期的全过程。图像中的鱼（斑马鱼）是一个中胚层带有报告基因的转基因鱼（Tbxta：GFP），Dextran-Alexa647标记间质。胚胎保持在28℃。

囊肿

a) 将稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在基质Matrigel中培养，在ibidi µ-Slide 8 Well玻片上诱导囊肿生长。环境被设定为保持恒定的37℃，5%的二氧化碳和高湿度。

在第2天，细胞已经显示出三维聚团，并在基质Matrigel内高度流动。

在第9天，囊肿保持生长相对稳定，并用较高的放大率（63倍）进行成像。采集6天的时间序列（6小时的时间间隔的GFP和IMC（明场成像的调制对比））。三维采集能获得囊肿的三维图像（418层，220.7纳米间距，总Z-Stack大小92.02微米）。在第9天，囊肿除了EB1-GFP标记之外，还被Mito-Blue、SiR-Actin和Tubulin-SPY555标记。

b) 5000个稳定转染了EB1-GFP的MDCK细胞在U型孔板中生长。有趣的是，这些细胞在几天后也形成了囊状结构。其中一个囊状结构在共聚焦模式下被进一步研究，以进行三维重建。

结果

短期的快速事件实验

U2OS细胞用两种不同的荧光染料标记相同的结构，WGA-Alexa488和WGA-Alexa555，它们都与细胞膜结合。通过在MICA序列模式下，这个实验设置能够在获取WGA-Alexa488（绿色）和WGA-Alexa555（红色）之间引入一个人为的时间差。有了MICA同时成像技术，两种不同的Alexa染料标记同样的膜结构，能够在最 小时间差的两个时间点成像。你可以在两种方法的比较中看到，在同步扫描中所有的囊泡都是黄色的——即绿色和红色的混合物，而在序列扫描中一些快速移动的囊泡看起来是两种不同的结构——即一个绿色和一个红色的囊泡。

中时程实验

斑马鱼是一种模式生物，经常用于发育研究。在这个例子中，我们感兴趣的是研究细胞在空间的协调性，而这种协调性受到周围组织的粘度的影响。在THUNDER模式下对两个通道进行了24小时的成像，并使用LVCC以获得更多的细节。 

长时程实验

MDCK细胞是极化的上皮细胞，如果在Matrigel这样的基质上培养，会成熟为所谓的囊肿。这些三维结构可用于研究发育过程和潜在的蛋白质运输机制。这里，细胞被稳定地转染了与GFP相连的微管结合蛋白，并在MICA中培养了3周。

图3：MDCK囊肿。3周的活细胞实验。时间间隔为6小时。扩展景深（EDOF）。上图：通道叠加。中图：EB1-GFP。下图：明场。THUNDER  LVCC技术。比例尺为20μm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

发育9天后，用活细胞染料对上述一些囊肿进行了染色，以观察肌动蛋白、微管蛋白和线粒体，GFP标记的微管结合蛋白，在共聚焦模式下对囊肿进行了成像。

图4：第9天的MDCK囊肿（CLSM）。除EB1-GFP(绿色)外，部分囊肿用Mitto - blue(品红色)、SiR-Actin(红色)和Tubulin-SPY555(黄色)染色，并用63x/1.20物镜在共聚焦模式下成像。比例尺 = 20 µm。图片由德国马尔堡菲利普斯大学的Ralf Jacob和Manuel Müller教授提供。

在U型孔板中培养细胞也可形成囊状结构。本实验中，MDCK细胞从第1天开始在MICA上培养并在明场和宽场荧光模式下记录，以研究囊肿的形成。MICA培养箱的特性使细胞在发展成囊状结构的过程中保持良好的状态。

培养14天后，在低倍镜共聚焦模式对囊肿进行成像，以确定一个感兴趣的囊肿。96孔板筛选样本以寻找合适位置来做进一步研究可能是很麻烦的。Navigator工具在此帮助实现样本的预览，并轻松地导航到相关的感兴趣的区域。

图5：用10x/0.32物镜和GFP通道对第14天的囊肿进行预览（CLSM）。

然后用63x物镜在LIGHTNING共聚焦模式下对其中一个囊肿进行了更细节的成像。63x/1.20水镜的加水是自动建立，并通过自动校正环对样品进行了优化。视频5显示了共聚焦和LIGHTNING的成像效果。

结 论

MICA适用于快速、短期到几周的长期活细胞成像实验，帮助用户获得可靠的结果。集成的培养系统在温度和pH值方面提供了接近生理的条件，使活细胞成像可以持续数周。另外，可以控制氧气水平，以获得更高的重要数据。FluoSync™技术可以同时对多达四个荧光团进行成像，这意味着可以对快速发生的细胞事件进行绝 对的时空相关性成像。此外，FluoSync™缩短了记录多色图像之间的间隔，从而提高了时间分辨率。THUNDER和LIGHTNING帮助用户从样本中提取更多的细节，借助OneTouch的照明和自动补水的流程，即使是仅接受少量培训和有限技术背景的人员都可以轻松使用。

参考资料

·Making Long-term Time-lapse Microscopy More Efficient, Science Lab (2022) Leica Microsystems.

·Hadanny, A.; Efrati, S. The Hyperoxic-Hypoxic Paradox. Biomolecules 2020, 10, 958.

·Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Molecular Motors.

明美显微镜相机应用于活细胞成像

研究活细胞时，常见的障碍包括光毒性和光损伤。 要捕捉快速的生物过程，关键是保持细胞健康并获得清晰的图像，确保数据可靠、无伪影，此次，深圳用户需要显微镜相机搭配蔡司倒置显微镜，用于活细胞成像观察。

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 来源：https://www.mshot.com/article/1641.html

肿瘤细胞在 3D 微环境中生长，与周围环境相互交流、相互作用。细胞行为在 3D 基质中培养与 2D 环境中不同。在许多情况下，3D 细胞培养设置更准确地反映了体内的状况。这包括使用球体和类器官的药物筛选，这些球体和类器官如今作为肿瘤模型是必不可少的。在分析癌细胞行为、迁移、增殖、对药物治疗的反应以及基因和蛋白质表达时，应考虑到这一点。

HT-1080 癌细胞在 3D 胶原蛋白凝胶中的侵袭。 将侵入性人纤维肉瘤癌球体 (HT-1080) 嵌入 I 型胶原蛋白大鼠尾凝胶中。 在 µ-Slide 8 孔中记录侵入凝胶基质 48 小时。 4x 物镜，明场

PDAC细胞和成纤维细胞的类器官共培养。 人yi腺癌 (PDAC) 细胞系 PA-TU-8988T（绿色，用 CellTrackerTM Green 染色）和鼠成纤维细胞系 mPSC4（红色，用 CellTrackerTM Orange CMTMR 染色）在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中的类器官共培养 . μ-Slide 覆盖有 25 μm FEP 箔，用于在直立光片显微镜期间匹配更接近水的折射率。 该图像由 MPI Muenster 的 S. Volkery 使用 M Squared Aurora Airy 光束直立光片设置获取。 样品由德国马尔堡大学的 K. Roth 提供。

用于 3D 癌症模型的 ibidi 解决方案

ibidi Collagen Type I, Rat Tail 是一种非胃蛋白酶处理的天然胶原蛋白，用于在凝胶基质中对 ECM 进行建模。其快速聚合促进了 3D 凝胶中的最佳细胞分布。

µ-Slide Spheroid Perfusion 是一种用于长期球体培养的专用灌流小室。 3 x 7 孔中的每一个都形成了自己的微环境（niche），用于培养标本。通过孔顶部的通道进行灌注（例如，通过使用 ibidi 泵系统）可确保在整个实验过程中实现最佳营养和氧气扩散，而不会使标本暴露在显著的剪切力下。

具有多细胞 µ-Pattern载玻片可实现空间定义的细胞粘附，用于生成球体和类器官、长期培养和高分辨率成像。确定的粘附点能够从细胞悬液中捕获所有粘附的单细胞。周围的 Bioinert 表面是完全不粘附细胞的。这迫使所有细胞在粘附点处相互聚集，从而以明确和可控的方式形成球体。

Bioinert 是一种稳定的生物惰性表面，用于在非粘附表面上对球体、类器官和悬浮细胞进行长期培养和高分辨率显微镜检查，无需任何细胞或生物分子粘附。它目前可作为 µ-Dish 35 mm、高 Bioinert、µ-Slide 8 Well 高 Bioinert、µ-Slide 4 Well Bioinert 和 µ-Slide VI 0.4 Bioinert。

在 µ-Slide III 3D 灌注中，单细胞、球体或类器官可以在凝胶层中或凝胶层上培养或嵌入 3D 基质中。特殊的通道几何形状允许以低流速进行灌注（例如，当使用 ibidi 泵系统时），确保最佳的氧气和营养供应。这种设置使长达数周的长期培养成为可能。此外，薄盖玻片底部可高分辨率成像。

µ-Slide 血管生成和 µ-Plate 血管生成 96 孔是凝胶基质上或凝胶基质中单细胞、共培养物、球体和类器官的 3D 培养和显微镜观察的简单、经济高效的解决方案。凝胶层直接连接到上面的培养基储存器，通过扩散可以快速轻松地更换培养基。对于特殊应用，还可提供带有 1.5H 玻璃底的 µ-Slide 血管生成载玻片。

μ-Slide I Luer 3D 设计用于在具有定义剪切应力的 3D 凝胶基质上或其中培养细胞。三个孔中的每一个都可以填充凝胶，细胞可以嵌入其中。对于定义流量的应用，顶部的通道可以连接到泵（例如，连接到 ibidi 泵系统），以确保最佳的氧气和营养供应。

参考文献：

3D Sandwich culture of squamous cell carcinoma lines using the µ-Plate Angiogenesis 96 Well

Hoque Apu, E., Akram, S. U., Rissanen, J., Wan, H., & Salo, T. (2018). Desmoglein 3 – Influence on oral carcinoma cell migration and invasion. Experimental Cell Research. 10.1016/J.YEXCR.2018.06.037

Breast tumor organoid culture in the µ-Slide Angiogenesis

Lüönd, F., Sugiyama, N., Bill, R., Bornes, L., Hager, C., Tang, F., Santacroce, N., Beisel, C., Ivanek, R., Bürglin, T., Tiede, S., van Rheenen, J., & Christofori, G. (2021). Distinct contributions of partial and full EMT to breast cancer malignancy. Developmental Cell. 10.1016/J.DEVCEL.2021.11.006

Live cell imaging of HT29 tumor spheroid co-culture with neutrophils and NET formation in the µ-Slide III 3D Perfusion

Teijeira, Á., Garasa, S., Gato, M., Alfaro, C., Migueliz, I., Cirella, A., de Andrea, C., Ochoa, M. C., Otano, I., Etxeberria, I., Andueza, M. P., Nieto, C. P., Resano, L., Azpilikueta, A., Allegretti, M., de Pizzol, M., Ponz-Sarvisé, M., Rouzaut, A., Sanmamed, M. F., … Melero, I. (2020). CXCR1 and CXCR2 Chemokine Receptor Agonists Produced by Tumors Induce Neutrophil Extracellular Traps that Interfere with Immune Cytotoxicity. Immunity. 10.1016/J.IMMUNI.2020.03.001

　　小鼠 L929 成纤维细胞的多细胞球体是在µ-Slide 球体灌注中创建的。在从细胞悬浮液中形成球体后，使用 ibidi 泵系统进行灌注。添加 ibidi Pump 可确保球体在长期培养过程中获得最佳营养。

　　在灌注培养 1 周后，将球体固定并用鬼笔环肽染色以观察 F-肌动蛋白细胞骨架。最后，球体被清除以增强成像深度和分辨率。我们使用EMOVI 方法进行具有成本效益、无害的整体成像，这可以在固定球体上实现基于抗体的多重免疫标记。球体的清除允许分析整个球体成纤维细胞甚至在球体成纤维细胞中心的成纤维细胞的分布和组织，同时保留球体的形态

　　01材料和试剂

　　细胞和试剂

　　•L929成纤维细胞（DSMZ，编号ACC 2）

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　•细胞培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　•细胞内 (IC) 固定缓冲液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　•Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS、Sigma、D8537）

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　•正常驴血清（Jackson，AB_2337258）

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼笔环肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，浓度20μg/mL，西格玛奥德里奇，D9542）

　　•去离子水 (diH2O)

　　•异丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　02缓冲液和溶液

　　培养基

　　•新鲜制备并在 4°C下储存长达一周

　　•基础培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　封闭和染色缓冲液

　　•PBS 

　　•1% （v/v）FCS 

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　染色液

　　•封闭和染色缓冲液

　　•1:500 鬼笔环肽（最终浓度 1x）

　　•1:10 DAPI（最终浓度 2 µg/mL）

　　30% / 50% / 70% (v/v) 异丙醇稀释液

　　•混合适当体积的 diH2O 和异丙醇

　　•使用前预冷至 4 °C

　　03 设备   

　　•ibidi 泵系统 (ibidi, 10902)

　　•具有生物惰性表面钝化的 ibidi µ-Slide 球体灌注（ibidi，80350）

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行连接器（ibidi，10830）

　　•ibidi 灌注套装蓝色 (ibidi, 10961)

　　•层流罩

　　•培养箱，37°C 和 5% CO2

　　•血细胞计数器（康宁)

　　•移液器(康宁）

　　•倒置共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）

　　•徕卡应用套件 X

　　•LIGHTNING（反卷积软件）

　　•Imaris v9.5

　　04 操作程序

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示.

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　点击请查看清除前后染色球体的直接对比视频 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　仅供科研使用！

　　细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。为了研究细胞迁移的机制，科学家们传统上转向“划痕试验”，它利用移液器尖端在多孔板中的单层细胞上“划痕”，并观察间隙所需闭合的时间（这些有时也被称为“伤口闭合”或“伤口愈合”分析）。这种类型的实验允许分析细胞迁移，并可以用各种药物和化学品来增强，以阐明特定的机制。

　　在 ibidi 35mm µ-Dish 中培养的内皮细胞，预置2-Well Culture-Insert。移除插件后，让细胞迁移 24 小时，然后固定在 4% PFA 中，并进行透化。VE-钙粘蛋白（洋红色）、 F-肌动蛋白用鬼笔环肽（绿色）和细胞核用DAPI（蓝色）的抗体染色，然后进行共聚焦成像。

　　Derek Sung, University of Pennsylvania School of Medicine：

　　我一直都有进行划痕分析。与大多数体外测定类似，一致性是获得准确和可重复结果的关键。作为进行过无数次此实验的人，使用移液器手动创建间隙存在一些过去给我带来麻烦的关键问题。这就是为什么发现 ibidi Culture-Inserts是一种救星。ibidi 细胞培养插件与传统的划痕检测方法相比具有许多优势：

　　1. 标准的间隙距离

　　传统划痕分析和使用移液管手动划痕大挑战之一是间隙距离不一致。而且，划痕往往划不直。因此，起始距离通常会在几十到几百微米之间变化。ibidi 的细胞培养插件中心会产生500 µm 无细胞的人造间隙。这确保了间隙是直的，并且每次的距离都是一致的。

　　2. 干净的迁移边缘

　　手动划痕还会产生未完全去除的自由浮动细胞的问题。这些自由漂浮的细胞可以通过延迟自由边缘的迁移、释放细胞内内容物或重新附着来影响迁移率。ibidi 的细胞培养插件是可移除的，留下干净笔直的边缘。

　　3. Z小化细胞数

　　传统的划痕检测是在多孔板中完成的，需要一层汇合的细胞。如果实验有多种条件（药物治疗或基因操作）并且需要多次重复，这会需要增加大量细胞。对于珍贵或昂贵的细胞（例如从难以获得的组织中分离出的原代细胞），这些实验可能变得难以进行。ibidi 的细胞培养插件具有较小的生长面积，可大限度地减少实验所需的细胞数量（准确地说，每孔0.22 cm 2）。这允许大限度地利用宝贵的细胞或增加重复次数。

　　4. 盖玻片底皿

　　划痕分析通常在多孔板中进行，底部厚，聚苯乙烯，只允许明场成像和间隙距离的量化。ibidi 的细胞培养插件具有经过组织培养处理和灭菌的盖玻片底部。这允许进行明场和免疫荧光成像。就我个人而言，我认为这是该产品好的方面，让我们能够看到如细胞骨架、细胞粘附形态、核形态等结构。此外，多模态成像功能大限度地提高了单个实验的数据量，从而节省了成本和试剂。

　　5. 单个实验的独立插件

　　“边缘效应”是指一种细胞培养现象，其中多孔板外周的孔比内孔经历更多的蒸发，导致不同的条件和潜在的不一致结果。使用多孔板进行划痕检测时可以看到类似的效果，影响结果的一致性和重现性。ibidi 的细胞培养插件单独包装，用于单次实验。这可以防止任何“边缘效应”并确保数据一致。另外，培养皿设计有盖子锁定功能，以确保在处理盘子时盖子保持打开状态。

　　与枪头划痕检测相比，ibidi 伤口愈合插件可提供更高的重现性

　　由于细胞迁移开放区域随时间发生变化。使用 ibidi Culture-Insert 2 孔（左）和用移液器吸头刮擦产生间隙的对比。数据来源：德国弗莱堡大学的 M. Börries。

　　乍一看，枪刮和放置插件的方法似乎是两种非常相似的创建无细胞间隙的方法。 然而，仔细观察，这两种方法可能在重要检测结果方面的影响有所不同：

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

　　免疫荧光实验原理

　　免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。

　　免疫荧光实验基于以下主要步骤：

　　1.特异性抗体与感兴趣的蛋白质结合。

　　2.荧光染料与这些免疫复合物偶联，以便使用显微镜观察感兴趣的蛋白质。

　　内皮细胞中vWF的免疫荧光染色。肌动蛋白用phalloidin染色(绿色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)。

　　区分直接和间接免疫荧光。在直接免疫荧光中，一抗直接偶联到荧光团（也称为荧光色素），便于处理和快速可视化。在间接免疫荧光中，使用特异性结合一抗的二级荧光团偶联抗体来可视化感兴趣的结。

　　尽管di二种方法比直接免疫荧光更耗时，但它有几个显著的优势，比如它通常更便宜，因为二抗可以用于不同的一抗。此外，通过结合多个一抗和特定的二抗(每个抗体都用不同的荧光团标记)，可以在单个样品中平行特异地显示多个蛋白质(多色免疫荧光)。

　　免疫荧光染色:典型的工作流程

　　每个免疫荧光染色方案由培养、固定、染色、成像四个主要步骤组成，可细分如下:

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小变化可能会导致不同的结果，而这些结果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精确地保持完全相同的条件是非常重要的(例如，细胞密度、抗体稀释度、培养温度和培养时间)。

　　免疫荧光实验方案对比

　　传统染色与ibidi方案染色

　　当使用任何ibidi解决方案时，ibidi的免疫荧光染色方案比传统方案要简便快速的多。无需在松散的盖玻片上生长细胞，细胞可直接在ibidi玻片上生长和染色。

　　用于免疫荧光应用的各种ibidi产品

　　更多ibidi相关产品的免疫荧光实验应用可查阅我们雷萌公众号相关文章！

　　参考文献

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

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高通量活细胞高分辨光片显微镜是近些年发展起来的一种成像技术，该技术在细胞与组织层面的实时成像对于深入理解生物学行为至关重要，尤其适合对直径达300 μm的光敏样品（如线虫、胚胎、类器官、果蝇和斑马鱼等活细胞）进行长期实时高分辨率和低光毒性的观察与3D成像。仪器在国外部署于马克思-普朗克研究所、居里研究所、欧洲分子生物学实验室苏黎世联邦理工学院等著名院所和机构，并已在高水平期刊发表多篇优秀文章：

[1]. So, Chun, et al. "Mechanism of spindle pole organization and instability in human oocytes." Science (2022)

[2]. Naganathan, Sundar R., Marko Popović, and Andrew C. Oates. "Left–right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension." Nature (2022)

[3]. He, Zhisong, et al. "Lineage recording in human cerebral organoids." Nature methods (2022)

[4]. Pérez-Núñez, Iván, et al. "LCOR mediates interferon-independent tumor immunogenicity and responsiveness to immune-checkpoint blockade in triple-negative breast cancer." Nature Cancer (2022)

[5]. Mailand, Erik, et al. "Tissue Engineering with Mechanically Induced Solid‐Fluid Transitions." Advanced Materials (2022)

[6]. Yang, Qiutan, et al. "Cell fate coordinates mechano-osmotic forces in intestinal crypt formation." Nature cell biology (2021)

[7]. Rossi, Giuliana, et al. "Capturing cardiogenesis in gastruloids." Cell stem cell (2021)

[8]. Dumortier, Julien G., et al. "Hydraulic fracturing and active coarsening position the lumen of the mouse blastocyst." Science (2019)

[9]. Serra, Denise, et al. "Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development." Nature (2019)

高通量活细胞高分辨光片显微镜简介：

瑞士Viventis Microscopy公司研发推出的高通量活细胞高分辨光片显微镜LS系列，是一款全新的光片成像平台，主要用于活体的光敏感样品（如胚胎、类器官等）的低光毒性、高分辨率的长期成像。系统在活体成像应用中具有众多优势：

★ 长期成像：通过稳定的温度和气相控制，在真实的生理环境下进行生物样品的培养与3D成像。

★ 简易上样：开盖式设计，很大程度简化上样操作；专用多孔样品室，可适应样品形状，在长期成像过程中可更换成像液

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