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氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。

随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

氨基酸作为构成多肽和蛋白的基本单元，是非常重要的一类化合物。
随着生物药的逐渐兴起，作为原料的氨基酸的质量分析的需求也越来越大。
大部分氨基酸由于至少同时含有大极性的氨基和羧基，因此整体极性很大，常用的C18柱+反相流动相对其保留很弱，同时部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此让流动相和检测器的选择更有挑战。

本文系统总结广州菲罗门积累经典色谱应用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析四种广受关注的应用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比较多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
虽然过程相对繁琐，但是通过衍生后，一举解决了氨基酸分析的两个难点：
保留和紫外吸收。
通过衍生反应在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基团，可以实现在C18柱+反相流动相的体系下进行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

当选择氨基酸非衍生直接分析时，对于有些疏水性比较好的氨基酸，可以直接用C18类柱子分析，比如：

可以选用带有HILIC作用的色谱柱实现保留，当使用磷酸盐类时，可以在截止波长条件下用UV检测，比较经典的应用是用ACE HILIC-B检测门鸟氨酸：

菲罗门也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS为检测器的条件下分析氨基酸。

三、保护型氨基酸手性分析

当氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保护起来时，可以用正相或者反相的多糖类手性柱实现非常好的分离，有现成的分析方法，可以极大地减少方法开发的时间。

四、非保护氨基酸直接手性分析

对于非保护的氨基酸，菲罗门推出AAOA分析柱，即通过键合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配体交换型手性柱。该手性柱手性柱可以用于拆分α-型有机酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、内酰胺和氨基醇等。

到目前为止，我们已经实现了有机酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也实现了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天门冬氨酸，D, L-缬氨酸，D, L-脯氨酸：

总结: 本文全面总结了氨基酸类的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保护型氨基酸的手性分析以及非保护型氨基酸直接手性分析。

对于具体氨基酸的分析如有疑问，可以电话020-22826668找到您专属的技术工程师。

菲罗门色谱柱选择卡

维生素（Vitamin）是一系列有机化合物的统称，Z先由波兰化学家卡西米尔∙冯克于1912年提出。

它是生物体所需要的微量营养成分，而一般不能通过饮食等手段获得。

维生素对生物体的新陈代谢起调节作用，适量摄取维生素可以保持身体健康，但过量摄取却可能会导致中毒。

维生素也是药店里保健品版块的热门品种。

但是ScienceDaily网站报道，近期，美国约翰霍普金斯大学发表在《内科年报》上的一份研究表明，几乎所有的维生素、矿物质和其他保健品都不能延长寿命或预防心脏病，而复合钙和维生素D补充剂可能会略微增加中风的风险。虽然这是可能存在争议的研究结果，但对于国内越来越热的维生素补剂市场也是起到了一定的降温作用。

维生素作为重要的食品或者饲料添加剂，在国标或者各种行业、企业标准都有涉及到含量的检测。本文分享一下我们对一些维生素分析的检测的案例：

一、食品中维生素A、D、E的测定（基于GB 5009.82-2016）

diyi法：食品中维生素A和维生素E的测定 反相GX液相色谱法

国标中用的是C30柱，水/甲醇的流动相体系，30 min的梯度方法，我们使用ACE C18-PFP，用磷酸溶液/乙腈体系，14 min的梯度方法就可以实现目标成分的分离，总体更节约分析时间。

第二法：食品中维生素E的测定 正相GX液相色谱法

国标中用的UPLC的酰胺基柱（1.7u，150*3.0mm）或者HPLC的Si 60硅胶柱（5u，250*4.6mm），以适配不同实验室的仪器条件。

其中用硅胶柱的方法中流动相使用了环境不友好的二氧六环，我们在开发方法中避开了该溶剂，使用的流动相为正己烷和异丙醇。

第三法：食品中维生素D的测定 液相色谱-串联质谱法

固相萃取柱（硅胶）：Superclean Silica 500 mg/6ml（货号：9B-T005-06500）

色谱柱：ACE Excel C18 1.7um 100*2.1mm（货号：EXL-171-1002U）

第四法：食品中维生素D的测定 GX液相色谱法

半制备正相GX液相色谱，色谱柱 ACE Excel SIL 5u 250*4.6mm（货号：EXL-127-2546U）

反相液相色谱，国标为甲醇/水=95/5的体系，我们用纯甲醇体系：

一、其他维生素分析应用（基于ZG药典和其他企业标准）

维生素包括脂溶性和水溶性维生素，由于在色谱上表现差异很大，很多会选择不同的色谱柱来分析。

比如ChP. 2015中使用氨基柱来分析水溶性的维C银翘片中维C的含量，但也有用户反馈这个方法的稳定性不是太好：

另外，对于大极性的水溶性维生素，也有用HILIC柱来分析，如使用TitanK HILIC来分析能量饮品中的水溶性维生素（混标）：

对于脂溶性维生素，除了TitanK C18，我们还有ACE C18-amide的应用，其中比较难分离维生素D2和D3的分离度非常不错：

Z后，如果大家有维生素分析的问题，欢迎咨询您专属的菲罗门工程师，我们可以提供案例分享、方法推荐和方法开发等服务，尽Z大可能为您解决分析难题。

菲罗门与ACE色谱柱的保养方法

色谱柱是一种消耗品，因此使用寿命有限。

对于大多数应用，色谱柱应持续进行500-2000次注射（进样），但这会因样品的清洁度、流动相的pH值和保护柱卡套的使用（是否使用保护柱）而不同。

这里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅胶基质）色谱柱的使用寿命。

一、色谱柱的平衡：当从一个流动相更换为另一个流动相时，或者在回收梯度（梯度循环）时，应需要10-20个柱体积。

下表显示了各种色谱柱尺寸（规格）的色谱柱体积。

如果溶剂的变化不太剧烈（例如80％至20％的ACN/水与ACN至THF（与之相对的由ACN至THF）），则需要的体积较少。

检查平衡Z简单方法是进行两次样品注射。

如果保留相同，则色谱柱充分平衡；如果保留变化，应增加平衡体积并重新试验。平衡与溶剂的体积有关，与时间无关。

所以较高的流量（流速）可以减少平衡时间。

                                        近似的色谱柱容量（mL）

二、色谱柱冲洗是一个简单的过程，可以通过清洗色谱柱中的顽固（保留较强的）物质来延长色谱柱的寿命。

每天结束色谱柱的使用时，应除去一切缓冲液（应除去色谱柱中的缓冲盐），然后用100％强溶剂（通常为ACN或MeOH，采用反相方法）冲洗色谱柱。

下一页列出的详细冲洗程序可以有效恢复色谱柱的性能，但应牢记：色谱柱是一种消耗品，因此请勿期望它能够永远的持续使用！

避免用100％的水冲洗反相色谱柱（嵌入极性基团或“AQ”色谱柱除外），因为相（固定相）去湿会影响清洗效果，而且流动相色谱柱的重新平衡会非常缓慢。

对于您的色谱柱，请按照以下所述的一般步骤，使用特定溶剂进行色谱柱冲洗。

应在冲洗之前查看制造商的建议（生产商说明书），以免损坏色谱柱。
1. 拆掉并翻转色谱柱（拆下色谱并反接）
2. 将色谱柱连接到泵上，而非检测器（不接检测器）
3. 用10-20个柱体积的溶剂进行冲洗，且流速不得高于QC色谱图的流速
4. 如果改变以下步骤，应确保在每个连续步骤中使用可混溶溶剂（溶剂可互溶）

反相色谱柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流动相无缓冲液
b. MeOH或ACN

如果金属离子被认为是污染的致因，应使用0.05M EDTA水溶液冲洗，然后用水冲洗，并按上述顺序冲洗。使用离子对试剂的色谱柱应专门用于离子对的应用之中。

未键合的硅胶柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

键合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

阴离子交换柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

阳离子交换柱（SCX，WCX）
a. 水（冲洗时注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白质的体积排阻柱
对于弱保留的蛋白质
a. 0.1M磷酸盐缓冲液，pH为3
对于强保留的蛋白质
a. 100％水至100％ACN的梯度，运行60分钟

三、色谱柱的合理存放有助于延长柱的使用寿命。

Z简单的存放步骤为：从柱中除去一切缓冲液，然后用10-20个柱体积的强流动相溶剂（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的顽固（强保留）物质。

然后用制造商指定的存储流动相，以10-20个柱体积的容量冲洗色谱柱（该信息应随色谱柱提供，并在QC检测色谱图中进行详细的说明）。

Z后，安全地盖上柱帽（拧紧堵头），以防流动相蒸发。
除了色谱柱制造商明确建议的特定情况（例如一些离子交换柱）外，请勿使用缓冲液或者少于约25％的有机溶剂来用于储色谱柱存储，因为它们会导致微生物的滋生。（保存色谱柱，以防微生物的滋生）

MARS MOA 使用指南
1、运行参数：
pH 范围：1.0 ~ 7.0
压力：正常使用压力约350 psi (24 bar)；ZG限压1000 psi (69 bar)。
流速：确保不超过ZD压力限制，一般流速不超过0.6mL/min。
柱温：一般使用温度为60 ~ 65°C；ZG温度上限为85°C。

2、开始使用步骤：
连接色谱柱前，先用过滤并脱气处理的HPLC 级纯水冲洗整个系统和管路。
连接色谱柱并启动柱温箱，先以0.1mL/min 的流速运行，确保压力在400psi 以下。随温度逐渐上升，用几分钟的时间将流速逐步上调，直到柱温达到操作温度时，将流速提高至指定流速。

3、结束步骤：
若过夜保存，缓慢降低流速至0.1mL/min 下运行，并保持实验柱温。
若长期不用，清洗保存后，关闭柱温箱并缓慢降低流速，ZH关闭泵，待系统冷却至室温后，卸下色谱柱并用柱堵头塞紧色谱柱。

4、避免事项：

突然升压；压力>1000 psi (69 bar)。MARS 系列对压力非常敏感，请设置仪器限压以保护色谱柱。
金属离子。
JD避免有机相如甲醇、乙醇、异丙醇，乙腈等。
无机改性剂HNO₃、H₃PO₄ 超过5%。
碱、盐。
机械冲击。请轻拿轻放，避免对色谱柱造成物理撞击。

5、流动相：经典流动相为0.005N H₂SO₄ 水溶液；使用前需对所有流动相进行过滤和脱气；需经常更换流动相以避免微生物污染；溶剂不互溶及盐的析出可造成色谱柱永 久性的损伤。

6、样品制备：请检验样品在流动相中的溶解性，尽可能采用流动相作为样品稀释溶剂；进样前需使用0.45或0.22μm 的滤膜过滤样品。

7、清洗与保存：0.005N H₂SO₄（HPLC 等级水溶液）。保存放置的色谱柱，应定期拿出来用其保存溶液冲洗，避免微生物污染。

由广东省药学会策划执行的2019第二届药物杂质分析分离学术研讨会在广州圆满召开。

本次会议得到了广州菲罗门、暨南大学、华南师范大学、岛津、研创、等有关单位的大力支持，为期两天的论坛共吸引行业人员300余人参加。

其次，还对药物中《基因毒杂质的分析》等有关话题分享了经验心得，就制药行业实验的发展与形势展开探讨，同时提出了色谱分析环节中的重要性以及实践战略与技术方案。

菲罗门作为金牌赞助商，将全力支持本次交流活动

菲罗门诚邀各位客户参与

活动介绍

会议安排

时间安排

承办单位

大会学术委员会

大会组委会成员

主任委员：章伟光

常务副主任委员：高昊

副主任委员（按字母顺序）：陈金香、曹德榕、李文佳、罗海彬、王健松、吴剑峰、谢斌、叶伟平

委员（按字母顺序）：陈国栋、范军、关东、何祥久、贺利民、胡丹、胡庆忠、胡祥龙、黄新安、贾丽、江正瑾、姜春来、雷红涛、赖烨才、李娟、廖国超、罗春、刘博、龙玉华、任娇艳、孙平华、吴月华、徐亮、徐振林、严春艳、张鸿、郑俊霞、郑盛润、周小明、周忠玉、朱秋华、王传喜

秘书：暴雪风、阮丽君

大会邀请演讲嘉宾

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各位客户：

      大家好！

      为了激励科研工作者，菲罗门特别设立期刊论文奖励，以鼓励科技创新者。

一、奖励设置

备注：一篇论文只奖励一位作者，有多位作者的请自行分配奖品

二、申请事项

1.国内各大高校化学、生物医药、食品检验、环保等相关专业的硕士、博士和博士后，各企业，事业单位的工作人员；

2.文章被刊载的时间为2019年8月1日以后；

3.文章中需要注明广州菲罗门科学仪器有限公司、色谱柱品牌和型号；

4.申请者需将已发表的学术期刊论文电子版发送邮件至 paul@gzflm.com 并抄送jerry@gzflm.com，更多详情请咨询020-22826668-828，刘经理。

核苷酸专用柱是什么柱？菲罗门为您解答

核酸碱基、核苷和核苷酸的HPLC分析

核苷是由含氮碱基与核糖或脱氧核糖缩合而成，核苷与磷酸合成核苷酸。核苷酸主要参与构成核酸，在人体内广泛分布，具有多种生物学功能，如与能量代谢有关的三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等。

为满足不同物质的分离要求，菲罗门推荐多款色谱柱对其进行HPLC分析。

一、 核苷异构体的分离

1.β-胸苷（dT）与α-胸苷的分离

ACE C18-AR是一种独特的C18键合的HPLC色谱柱，结合了C18烷基链的疏水作用和苯基的芳香选择性，而且可以耐水相，非常适合芳香化合物的分离。

色谱条件：

色谱柱ACE Excel C18-AR 5μ 150 × 4.6 mm

货号：EXL-129-1546U

2.尿苷和阿糖尿苷的分离

ACE C18-Amide是一款嵌入极性酰胺基团的C18柱，相当于同时具备C18与酰胺基的选择性，同样耐水相，很适合分析含氢键给体的物质。

色谱柱：ACE Excel C18-Amide 3μ 100 X 4.6 mm

货号：EXL-1112-1046U

二、 核酸碱基和核苷的分析

ACE HILIC-N是ACE三款亲水作用色谱柱中的中性柱，相对于阴阳离子都显示出较低的离子交换能力，通过极性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）来保留分离核酸碱基、核糖核苷和脱氧核糖核苷。

色谱柱：ACE HILIC-N 5μ 150 X 4.6 mm

货号：HILN-5-1546U

三、 核酸碱基、核苷和核苷酸的分析

Titank C18有机硅胶杂化色谱柱，是在硅胶的硅氧网状构造中以更加稳定的烷基来取代在碱性条件下不稳定的硅氧桥连接，具有宽pH耐受范围（1-12）、低背压和水相稳定的特点，对于较大极性的物质有很好的保留。

色谱柱：菲罗门 Titank C18 3μ 50 × 3.0mm

货号：FMB-5559-YONU

四、 单磷酸核苷酸的分离

ACE NH2是氨丙基键合的硅胶柱，与ACE其它固定相的色谱柱一样，都是采用超惰性的硅胶制成，具有很好的稳定性和使用寿命。

色谱柱：ACE Excel 3μ NH2

货号：EXL-1114-1546U

五、 九种核苷酸的分离

Comixshell AIRP是阳离子嵌入烷基键合的核壳硅胶柱，同时具有反相和阴离子交换选择性，是Comix系列色谱柱中的一种。

Comix系列色谱柱可以用来同时检测无机和有机化合物、分离大极性物质及复杂体系。

色谱柱：菲罗门 Comixshell AIRP 2.7μ 150 × 4.6 mm

货号：FMF-AIRP-EONU

总之，不同的疏水性或是极性作用力的固定相可以提供不同的选择性，所以选择正确的固定相是至关重要的一步。

        误区1：HPLC 柱不可以反冲

        这是不正确的。通常情况下液相色谱柱所设计的耐压值是远高于最da操作压力的。换柱时反冲可以清洗柱头一些具有强吸附性质的物质，我们冲洗出这些残留物质也是为了防止压力增大。但是如果你购买的色谱柱在柱头使用了大粒度的填料，这时你反冲会冲出这一部分填料。因此你要先检查一下自己使用的液相色谱柱再选择是否反冲。

        误区2：所有的C18（L1）色谱柱都是一样的

        这是不正确的。在早期的HPLC体系中，C18是唯yi反向色谱的键合固定相，因此C18就作为了反向色谱柱的标准。但是时代不会一直停滞脚步，人们对于科学的追求与理解愈发深刻，更多的固定相出现了，诞生了许多C18色谱柱。虽然同样是选用硅胶作为基体，但各自都有自己特定的填料键合合成工艺，因此色谱性能也不相同。所以单纯的因为名称都是C18色谱柱，想当然觉得性能都一样是不对的。

        误区3：色谱柱里一旦进入空气就会损坏

        我们都知道当色谱柱不与色谱仪连接的时候，需确保色谱柱被紧紧地密封。但是在实际应用中，即使色谱柱的端部进入了少量的空气也不是很严重的事情。当色谱柱连接到色谱仪上使用时，在系统初始加压阶段，在很短的时间内空气就会被溶剂挤压排出。所以，不要因为色谱柱进入了少量空气就认为色谱柱已被损坏。

        误区4：保护柱是没必要的

        这也是太JD的误区，其实使用保护柱有很多好处。HPLC的移动相中常使用各种试剂，其中会混有一些不溶解物质或不纯物质。多数不溶物通过使用筛板或膜滤器过滤移动相可以除去，但极细小的粒子还是无法完全过滤。此外在移动相调制之后，还有通过空气、容器、人体等有不溶物、不纯物落入的可能性。这些不溶物、不纯物质会污染柱、或使堵塞、或给分析带来不良影响等。这时通过在色谱柱前安装分析保护柱可以防止其产生，能起保护色谱柱的作用。相较于更换一根昂贵的分析柱，添加或更换保护柱只需要很少的花费。恒谱生液相色谱保护柱几乎无死体积、便于更换，适用于UHPLC系统的高压，将那些强保留的、不可吸附的化合物截留下来。样品和流动相的过滤可以维护保护柱对化学污染物的吸附容量，能够更长时间的维护柱效，延长色谱柱的使用寿命。

        误区5：反相色谱柱不可以使用纯水相

        这也是不正确的，有些色谱工作者在使用低有机溶剂含量或者纯水作为反相色谱柱的流动相时，发生相塌陷的现象，所以有些人认为反相色谱柱不可以使用纯水相。但事实上市场上销售的反相色谱柱（如极性嵌入和极性封端柱）都是具有水浸润性的，其表面特性是允许使用纯水的，不会导致塌陷或者保留时间移位。

        误区6：色谱柱填料粒径越小、压力越高，分离效果越好

　　色谱柱性能的好坏不能单纯用填料是否是超小的粒径以及超高的柱压来评估。现代对于色谱柱的柱特性研究越来越深入，已经研发了一些能够提高色谱柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色谱柱，其柱效与sub-2µm UHPLC柱效一样好，与常规的LC填料色谱柱比起来，柱压很低。

　　误区7：柱压不会影响色谱分离效果

        近年来，柱压的问题引起了很多色谱工作者的注意，柱压是色谱的很多参数都是受柱压影响的，包括部分溶质的摩尔体积、停滞体积、柱孔隙度、保留因子、流动相密度、介电常数、固定相结构、pH值和电离常数等。当色谱柱在约2000psi（13.789MPa）压力下运行时，即使保留时间上存在小差异，也并不会引起我们的注意；特别是如果重复性较好及定量不受影响的时候。但是，当柱压接近2000psi（13.789MPa）时，柱压的影响可能就相当明显了。

        近几十年来，液相色谱法被广泛应用于生命科学领域，药物分析，食品分析，环境监测等领域，人们对于液相色谱法的不断研究，也诞生出更多的液相色谱应用以及解决方法等，相信未来液相色谱法的应用领域会更加广阔。

1.利用ACE键合相的固定相选择

分离度方程式可以确定影响分离度的参数：柱效（N）、容量因子（k）和选择性（α）。

在过去几年里，柱效和使用超GX色谱柱（被称为“UHPLC”色谱柱）作为实现分离目标的手段已得到了极大的重视。

UHPLC已通过更快速的分离和更快速的方法开发提高实验室生产力来证明了其价值。

然而，选择性往往被忽视，且其重要性也被强调柱效所掩盖。这是令人遗憾的。

在影响分离度的三个参数中，选择性是Z为重要的。

（参见图1）通过利用柱效和选择性，通常可以实现更好和更快的分离。

图 1：N、α和k对分离度（Rs）的影响

提高N，α或k可以提高分离度（Rs）。

然而，从这些图中可以看出，随着N或k值的提高，对分离度的改善效果也逐渐降低。

另一方面，提高选择性（α）则没有这个问题，因此其成为开发分离方法时的Z佳优化变量。

在反相色谱中，固定相与分析物之间存在多种相互作用的机制，这可以用来实现分离。

这些相互作用机制包括：疏水性结合、π-π、氢键、偶极-偶极和形状选择性。

不同类型的键合相将提供其中一种或多种相互作用机制。表1列出了ACE键合相和每种可能的主要相互作用机制，这取决于分析物和流动相条件。

表1: 比较不同键合相的分离机制/相互作用                                                                                  

利用键合相的选择性实现更好的分离。
图2表明了两种ACE键合相即C18-AR与苯基之间的选择性差异。
尽管两种键合相提供了强π-π和偶极-偶极相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用机制（特别是疏水性结合）的强度方面，它们存在显著差异。

C18-AR可能具有其它不同的分离机制，可以为复杂的混合物带来更好的分离效果。对于其他混合物，可能不是这种情况，这是ACE键合相的优势。

当开发分离方法时，ACE键合相可以提供各种可供选择的重要保留机制。

非常强大且独特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色谱柱中可以获得。
通过利用柱效和选择性，可以实现更好的分离。

图 2：C18-AR与苯基相之间选择性差异的比较

色谱柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流动相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
温度： 60 ℃
检测： UV 214 nm
梯度： 5分钟内从3至B，并持续1分钟。

样品：
1. 甲硝唑
2. 3-羟基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水杨酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎宁
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡罗昔康
16. 卡维地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，这可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的选择性。还要注意C18-AR与苯基相的洗脱顺序有很多变化。

图3给出了键合相选择能力的另一实例。

一个分离是用C18键合相的UHPLC色谱柱完成，另一个分离是用C18-PFP键合相的UHPLC色谱柱完成。

C18-PFP键合相提供的额外分离机制，使得总体分离效果更佳出色。

图 3：ACE Excel可以获得zhuo越的分离度和峰形：药物及其相关物质的UHPLC结果

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
流动相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分钟内从3至B
流速：0.6 mL/min
温度：40 ℃
检测：UV 254 nm

样品
1. 对乙酰氨基酚
2. 氢氯噻嗪
3. 甲基苯基亚砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色谱柱和C18-PFP色谱柱上同样快速地产生色谱图。

然而，C18-PFP色谱柱可以为色谱峰对（13,14）和（15,17）提供更佳的选择性，因此能够提供优越的总体分离性能。

2.ACE和ACE Excel硅胶基质固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响，并且在为碱性化合物提供zhuo越峰形方面赢得了口碑。  

峰拖尾可以降低分离度，降低灵敏度，甚至干扰准确度和精密度（图4）。  

峰拖尾有许多潜在的原因，但分离碱性物质时的主要原因是硅胶固定相载体颗粒表面上的酸性硅醇基与分析物上的氨基之间的相互作用（图5）。  

图 4：峰拖尾对分离度和灵敏度的影响  

随着峰拖尾（Tf，拖尾因子）从1.0增加到2.0，分离度（Rs）从1.5下降到0.87。  

由于峰宽增加以及峰面积保持不变，灵敏度（峰高）也随着峰拖尾的增加而下降。  

ACE色谱柱采用具有极低硅醇活性的超惰性硅胶制成。  

这种超纯硅胶采用ZL技术进行有效键合和彻底封尾。  

导致这种硅胶基质的固定相几乎消除了硅醇基对色谱分离的不利影响。  

ACE色谱柱的超惰性特性使其成为分离极性碱性化合物的理想选择。  

当分离复杂碱性化合物时,与其他现代碱性去活色谱柱相比，ACE色谱柱总是能给出明显更好的峰形和柱效（图6）。  

图 5：峰拖尾相互作用  

硅胶固定相载体表面上的酸性硅醇基可形成与碱性化合物相互作用的离子交换位点。  

这种离子交换的相互作用通常可以导致峰保留（二次保留），并当采用反相HPLC分离胺类化合物时引起峰拖尾。  

一种几乎消除了硅醇基对色谱分离不利影响的硅胶基质固定相  

图 6：峰拖尾比较  

条件
色谱柱尺寸：50 x 2.1 mm
流动相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
温度：22ºC
样品：吡啶  

报告了碱性化合物（吡啶）在各种常见C18色谱柱上的塔板数。  

在10％峰高下测量塔板数，以使峰拖尾纳入在测量中。  

ACE C18-PFP由于其超惰性性质而达到了Z高塔板数。  

3.ACE Excel为UHPLC带来了享有盛誉的ACE HPLC性能  

重要的是要认识到色谱柱的选择性和柱效是独立的变量，在开发分离方法时您不必选择使用一种而不使用另一种。事实上，为了实现Z佳的总体分离效果，您应当对上述两个变量以及保留值进
行优化。当需要实现高速分离时尤其如此。（参见图7）  

图 7：利用柱效和键合相选择性来开发更快的分离方法  

条件：
流动相：  

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱温：40℃
检测：PDA, 254nm  

样品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯  

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色谱柱更高的柱效，可在更高的流动相流速下使用更短的色谱柱，以使这种混合物的分离时间缩短80%（相比HPLC色谱柱）。
然而，也可以通过优化键合相的选择性来进一步缩短分离时间，在这个案例中，就是利用了C18-PFP键合相所具有的增强的选择性。

与C18UHPLC色谱柱、C18 HPLC色谱柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色谱柱分别将混合物的分离时间缩短了80％以上以及96％，同时保持了所有峰的分离度。

ACE Excel UHPLC色谱柱的设计旨在充分利用低扩散、超高压UPLC®和UHPLC仪器（高达1000 bar），并可与所有市售UPLC和UHPLC系统相兼容。
ACE Excel UHPLC色谱柱可以为碱性化合物提供更佳的峰形，改善柱子与柱子之间的重现性，提供额外的利用多种分离机制的固定相，以及改善色谱柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色谱柱的可用性意味着色谱分析师在使用UPLC和UHPLC仪器时有更多的选择来获得更好的结果。

图 8：ACE Excel色谱柱提供快速、高分辨率的分离

条件
色谱柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流动相：60秒内从30%B至B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱温：40ºC
压力：703 bar (10,335 psi)
检测：PDA, 254 nm
仪器：安捷伦1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色谱柱可在不到60秒内提供这9种分析物的基线分离。

4.已经证实ACE HPLC色谱柱和ACE Excel UHPLC色谱柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和zhuo越的色谱柱寿命。  

通过键合在硅胶固定相载体上的硅氧烷的酸化水解可以失去键合相，从而降低色谱柱的寿命。该酸水解随着流动相pH的降低和柱温的升高而增加。  

与C18相相比，较短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去键合相。此外，低纯度的硅胶固定相载体和低表面覆盖的固定相载体使得一些键合相更易于酸解。
由于使用超高纯度的硅胶固定载体粒子以及键合相的极高表面覆盖，ACE键合相表现出极高的稳定性。（参见图9）
尽管所有ACE键合相的稳定性都很优异，但是一些键合相并不像其它键合相那样稳定。例如，通常认为C18键合比柱长较短的烷基相、PFP相和苯基键合相更稳定。  

实际上，典型的苯基固定相稳定性不佳是该相在方法开发中不常被选择的主要原因之一。
为了解决这个问题而开发了ACE C18-AR，其允许色谱分析利用强大的π-π和偶极-偶极分离机制，并仍然享有C18相的坚固性及耐用性。  

如图10所示，ACE C18-AR不仅对典型的苯基键合相具有非常优异的稳定性，它甚至还比许多其他C18键合相表现出更佳的稳定性。  

类似地，ACE C18-PFP提供了多种分离机制，可以利用它们实现更佳的总体分离效果，同时从C18相的稳定性中受益。  

图 9：酸稳定性，pH 1.8  

条件
色谱柱：ACE 4.6 x 150 mm
流动相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
温度：22 °C
分析物：菲  

酸性暴露条件：
流动相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
温度：22 ℃  

图10：加速柱稳定性研究：pH 1.9时80℃  

酸性暴露条件：
流动相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
温度：80 ℃
色谱柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲  

使用设计用于加速柱降解下的条件，ACE C18-AR相显示保留损失极少，其寿命相当于高度稳定的ACE C18相。两种固定相均由相同的超纯硅胶而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾视作在高温和低pH条件下具有极好稳定性的固定相）。
正如预期的那样，基于低纯度硅胶（Waters Spherisorb ODS2）的C18键合柱在这些加速条件下寿命大大降低。
特别值得注意的是常规苯基色谱柱与ACE C18-AR的寿命比较结果。与ACE C18-AR相比，尽管使用高纯度二氧化硅，苯基色谱柱的寿命仍降低，这表明ACE C18-AR可能适用于那些使用苯丙基色谱柱寿命短的应用。  

将HPLC和UHPLC连接到通常被称为LC-MS的质谱仪上已经相当普遍。  

然而，质谱对可能从HPLC/UHPLC色谱柱上洗脱下来的微量的键合相（称为柱“流失”）非常敏感。柱  

流失可能会干扰分析结果，并且重要的是，LC-MS应用中所选择的色谱柱具有足够稳定的键合相以避免过量的柱流失。  

图11表明ACE C18-PFP色谱柱几乎没有“流失”干扰LC-MS分析。  

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的稳定性使得这些色谱柱更适合LC-MS应用。  

图 11：ACE C18-PFP色谱柱的低柱流失使其成为LC/MS应用中的理想选择  

条件
色谱柱尺寸：50 x 3.0 mm
流动相：梯度：在5分钟内从5至95% B，95% B时持续5分钟
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
温度：60ºC
检测：安捷伦1100 MSD ESI正离子快速扫描模式,快速扫描全50 – 1000 m/z
样品：空白运行  

柱流失可能会干扰LC-MS应用中目标分析物的检测和测量。  

ACE C18-PFP色谱柱未显示柱流失。  

所有ACE色谱柱的低流失特性使其非常适合LC-MS应用。  

UHPLC色谱柱可能缺乏耐用性。加上入口筛板堵塞的可能性，您可能面临色谱柱的耐用性不如HPLC色谱柱的问题。  

ACE Excel色谱柱非常宽容，并提供您期望从HPLC色谱柱中获得的相同耐用性和使用寿命。  

ACE Excel将改变您对UHPLC色谱柱耐用性的看法。  

ACE Excel色谱柱不仅填装的更好，还采用了ZL的入口筛板设计，使其比其它UHPLC色谱柱更不容易被堵塞。  

仍建议您像使用任何UHPLC色谱柱一样过滤样品和流动相，但ACE Excel色谱柱比其他UHPLC色谱柱更为宽容，并提供与HPLC色谱柱相同的耐用性和使用寿命。  

图 12：ACE Excel色谱柱在耐用性方面有良好的口碑  

将2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色谱柱在平均1,000 bar（14,500 psi）压力下进行2000多个梯度的运行。  

在该稳定性研究结束时，柱效（塔板数）和保留时间基本保持不变。  

5.ACE Excel色谱柱具有口碑zhuo越的可重现性。  

柱子与柱子之间的可重现性受硅胶固定相载体的生成、固定相与固定相载体的键合以及色谱柱中固定相的填充的影响。  

在色谱柱的制备过程中，每个阶段被控制得越好，色谱柱的可重现性和质量则越好。
ACE色谱柱在色谱柱制备过程中的每个阶段均得到了全面控制。  

这些控制措施确保ACE色谱柱在柱间以及批次之间产生可靠且可预测的性能。  

图13提供了典型批次验证测试的实例。  

硅醇活性的细微变化是柱子与柱子之间选择性变化的主要原因之一。  

ACE和ACE Excel色谱柱由于使用超纯试剂和严格的制造工艺控制（可以获得具有均一表面特性的高纯度硅胶固定相载体）而具有出色的可重现性。  

将这种高纯度硅胶与先进的键合技术相结合，可以产生一系列高惰性的固定相，这些固定相几乎消除了色谱中的硅醇干扰，从而提供zhuo越的柱子与柱子之间的可重现性。  

6.ACE色谱柱可以提供从UHPLC到HPLC再到制备型HPLC的易扩展性。  

相同的质量控制，可以确保不同批次色谱柱的高重现性，也可以保证您更容易地在UHPLC和HPLC方法之间进行转换，或需要分离和纯化目标化合物时放大到制备应用上。  

柱效当然会改变，但可以预料的是，谱带间距（选择性）将相同。  

图14阐明了当使用相同的ACE键合相但不同粒径填充的色谱柱进行操作时，可以预见到分析物一致的谱带间距类型（选择性）。  

图 14：将ACE固定相从UHPLC（2μm）扩展到HPLC（3μm和5μm）再至制备型HPLC（10μm）时，选择性得到了保留与保证。

条件
流动相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
温度：22 ℃
波长：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羟基苯甲酸
3. 乙酰水杨酸
4. 苯甲酸
5. 2-羟基苯甲酸
6. 对羟基苯甲酸乙酯

试验样品的这些色谱图在填充有相同的键合相但不同粒径的色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明分离从UHPLC扩展到HPLC再到制备型HPLC的容易程度。

当使用ACE Excel UHPLC色谱柱进行快速方法开发，且该方法必须可转移到HPLC时，易扩展性则显得特别有价值。

图 15：ACE固定相可以提供相同的选择性，无论它们是UHPLC、HPLC还是制备型HPLC色谱柱

条件
色谱柱：2.1 x 50 mm
流动相：1.4分钟内从30% B至90% B
A = 20mM甲酸铵+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B时持续0.30分钟，在1.10分钟内从30至90％B，在90％B时持续0.40分钟
流速：0.5 mL/min
柱温：30ºC
检测：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式运行
仪器：岛津Prominence UFLC系统

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普罗替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

试验样品的这些色谱图在ACE Excel C18 2μmUHPLC色谱柱、ACE C18 3μmHPLC色谱柱和ACE C185μm色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明ACE固定相的选择性一致，无论填充粒径如何。

这使得从UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法转移更加容易。同时也使得从分析型应用扩展到制备型应用更加容易。

        大家都知道HPLC色谱柱的寿命是有限的，在使用过程中随着时间的推移，其性能开始下降。你可以通过峰形和峰形之间的分离，柱背压的不规律增加以及重影峰的出现来判断HPLC色谱柱的性能出现了下降。色谱柱是昂贵的色谱耗材，平常使用完毕后需要保养。如果色谱柱真的发生了性能下降，有什么方法可以恢复呢?

        首先，如果色谱柱由于过载或使用不兼容的流动相而结垢，是可以恢复的，但已经损坏的色谱柱或已经过使用寿命的色谱柱无法恢复，需要更换。

        色谱柱还原程序如下，供大家参考：

        反相柱

        反相分离是大多数HPLC分离中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相组成。建议以水-乙腈-异丙醇-庚烷-异丙醇-乙腈-流动相的顺序用10至20倍体积的溶剂洗脱

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍体积的溶剂冲洗，按照庚烷-异丙醇-乙腈-

       水-异丙醇-庚烷的顺序。

        GPC / GFC色谱柱

        用5倍体 积且PH值为3的0.1%磷酸盐缓冲液冲洗。如果使用了保留力强的蛋白质，则使用从水到乙腈再到水的60分钟梯度液冲洗。

        色谱柱在使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行（出厂测试所使用的条件是zui佳条件），只有这样，测得的结果才有可比性。

        恒谱生色谱柱柱管由不锈钢制成，不锈钢柱内壁多经过抛光，减小管壁效应，提高柱效，柱中填充键合硅胶或聚合物填料。色谱柱基于高纯硅胶，采用独特键合技术，具有优异的峰形，灵敏性好。基质金属含量低，对所有类型的分析物均表现完好峰形。机械强度高，稳定性好，质控严格，确保色谱柱性能和色谱柱的使用寿命。有多种尺寸规格可供选择以适应色谱工作者及其使用的不同需求。我们有专业的技术工程师团队为您的需求提供解决方案，欢迎前来咨询了解！

上篇文章《寡核苷酸类药物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色谱柱应用例》中我们提到了随着寡核苷酸药物的研发步伐越来越快，对高纯度寡核苷酸产品的需求也日趋旺盛。目前，寡核苷酸主要是通过化学合成法制成，在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质，离子交换液相色谱法是分析这些杂质的重要手段之一。此篇文章我们将介绍尺寸排阻色谱法在寡核苷酸药物质量控制中的应用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分离模式是基于碱基数量、磷酸基不同导致的分子量差别进行分离，通常用于简单的质量控制或纯度研究。该模式的优点是可以使用接近生理条件的洗脱溶液进行等度分离。有时也会添加水溶性有机溶剂来YZ疏水吸附。

分析不同碱基数目的寡核苷酸

下图是采用两根串联的SEC色谱柱TSKgel UP-SW2000来区分长度相差一个碱基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是东曹生命科学ZX开发的粒径2μm、孔径12.5nm的硅胶基质SEC色谱柱，主要用于分离分子量范围为1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。该色谱柱兼容HPLC和UHPLC系统，因此也能够从传统的HPLC-SEC方法转换到UHPLC。

下图是使用TSKgel G2000SWXL色谱柱分离不同碱基数量的合成寡核苷酸混合物的谱图。为了YZ核酸酶活性，有时会在流动相中添加EDTA等约1 mmol/L的螯合剂。

SEC法分离脂质体包被的siRNA

下图是使用TSKgel SuperSW2000色谱柱对天然型DNA核酸药物Defitelio进行质量分析的示例。

参考文献：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色谱柱

下表中列出了适用于核酸分离的SEC色谱柱。对于＜375 bp的短链核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL这几款色谱柱都是比较推荐的。

概述

寡核苷酸是一类只有50个以下碱基的短链核苷酸的总称（包括脱氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近几年，随着寡核苷酸疗法在ZL各种疾病适应症方面取得了临床上显著的进展，已有多种寡核苷酸类药物，如小干扰RNA (siRNA) 和反义寡核苷酸 (ASO) 药物获得了FDA上市批准。另外还有多种microRNA (miRNA) 和适配体 (Aptamer) 正在研发中。因此，更大量、更高纯度的寡核苷酸产品的需求也随之日益增长。

东曹生命科学提供多种具有高分辨率、选择性的色谱柱和层析填料产品以满足从分析到纯化制备不同规模的应用需求。

寡核苷酸的HPLC分离模式

下表中列举了寡核苷酸HPLC分析的几种分离模式及适用的分离条件。也可以通过连用MS进行检测。

ZL性寡核苷酸是由固相化学合成法制成。在合成过程中会产生工艺相关杂质和产品相关杂质。产品相关杂质包含许多目标产物的类似物（分子量的差别：碱基数n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不对称化合物、异构体等。因此，杂质的分析监控对工艺和质量控制就显得十分重要。一般而言，通过阴离子交换色谱法即可实现这一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下图是使用TSKgel DNA-STAT阳离子交换色谱柱分离具有不同序列的4种寡核苷酸引物 (单链) 。

在IEC分离模式中，如果使用无孔填料的色谱柱可以提高分辨率。此款色谱柱采用的是亲水性无孔树脂填料，粒径5μm，表面由开放型多层阴离子交换基团构成。这些特性与创新的化学键合方法相结合，使其载量更高、操作压力更低，非常适合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的纯度检测

在离子交换色谱柱中，可以对离子基团与主成分有一处不同的化合物进行分离，比如能够分离n-1、n、n+1的化合物。下图是TSKgel DNA-NPR阳离子交换色谱柱对13个碱基的硫代磷酸寡核苷酸粗样分析的色谱图。

TSKgel DNA-STAT色谱柱对粗制的寡核苷酸与纯化后的样品进行纯度评估。

寡核苷酸的分析要点

1、根据核酸样品的稳定性和大小来选择合适的洗脱液。如果核酸的稳定性很高，可以采用碱性溶液 (NaOH，pH12) 和高温60℃条件下分离，可提高分辨率。如果是稳定性差的，则推荐使用pH7-8的中性洗脱液，温度40℃条件下分离。

2、在样品吸附强的情况下，可使用比NaCl或NaBr洗脱能力更强的NaClO₄进行梯度分离。

3、如果样品是超巨大双链DNA (如质粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的话不仅可以获得高分辨率，而且回收率也会更好。

ACE色谱柱可以提供从UHPLC到HPLC再到制备型HPLC的易扩展性。

相同的质量控制，可以确保不同批次色谱柱的高重现性，也可以保证您更容易地在UHPLC和HPLC方法之间进行转换，或需要分离和纯化目标化合物时放大到制备应用上。

柱效当然会改变，但可以预料的是，谱带间距（选择性）将相同。

图14阐明了当使用相同的ACE键合相但不同粒径填充的色谱柱进行操作时，可以预见到分析物一致的谱带间距类型（选择性）。

图 14：将ACE固定相从UHPLC（2μm）扩展到HPLC（3μm和5μm）再至制备型HPLC（10μm）时，选择性得到了保留与保证。

条件
流动相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
温度：22 ℃
波长：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羟基苯甲酸
3. 乙酰水杨酸
4. 苯甲酸
5. 2-羟基苯甲酸
6. 对羟基苯甲酸乙酯

试验样品的这些色谱图在填充有相同的键合相但不同粒径的色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明分离从UHPLC扩展到HPLC再到制备型HPLC的容易程度。

当使用ACE Excel UHPLC色谱柱进行快速方法开发，且该方法必须可转移到HPLC时，易扩展性则显得特别有价值。

图 15：ACE固定相可以提供相同的选择性，无论它们是UHPLC、HPLC还是制备型HPLC色谱柱

条件
色谱柱：2.1 x 50 mm
流动相：1.4分钟内从30% B至90% B
A = 20mM甲酸铵+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B时持续0.30分钟，在1.10分钟内从30至90％B，在90％B时持续0.40分钟
流速：0.5 mL/min
柱温：30ºC
检测：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式运行
仪器：岛津Prominence UFLC系统

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普罗替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

试验样品的这些色谱图在ACE Excel C18 2μmUHPLC色谱柱、ACE C18 3μmHPLC色谱柱和ACE C185μm色谱柱上以相同的流动相条件运行，结果阐明ACE固定相的选择性一致，无论填充粒径如何。

这使得从UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法转移更加容易。同时也使得从分析型应用扩展到制备型应用更加容易。

尿激酶是从新鲜人尿中提取的，或从人肾组织培养中获得的一种酶蛋白，是临床上一种常用的溶解血栓的药物。它由高分子量尿激酶 (Mw=54000) 和低分子量尿激酶 (Mw=33000) 组成的混合物。

为使尿激酶达到ZJ分离效果，本应用使用粒径2 µm的TSKgel UP-SW2000超GX液相尺寸排阻色谱柱与G2000SWXL色谱柱，对尿激酶进行了对比分析。

溶液的配制

色谱流动相配制：0.2 mol/L磷酸二氢钠水溶液，用磷酸调pH至3.0 。

样品：尿激酶测试方法优化溶液浓度：2.5 mg/mL

分析条件

仪器：Thermo Ultimate3000

色谱柱1：TSKgel UP-SW2000 (2µm, 4.6 mmI.D.×30cm)

色谱柱2：TSKgel G2000SWXL (5µm, 7.8 mmI.D.×30cm)

流速：0.18 mL/min for UP-SW2000、0.5 mL/min for G2000SWXL

柱温：25℃

样品盘温度：10℃

进样量：10 µL

检测器：紫外检测器@280nm

分析结果

图1.  UP-SW2000色谱柱分离谱图

图2.  G2000SWXL色谱柱分离谱图

结果与讨论：

相较于G2000SWXL色谱柱，TSKgel UP-SW2000对多聚体、高分子量尿激酶、低分子量尿激酶的分离度均有所提高。

同时对比了等量溶质不同进样体积，高浓度样品小进样量，分离度较好一些。UP-SW2000色谱柱可满足药典要求：高分子量尿激酶峰面积占90%以上，且与低分子量尿激酶分离度大于1.0。

环丙沙星是 1987 年上市的shou个氟喹诺酮类药物，作为一项重要的医学突破，推动这一新型抗生素的进一步研究。1981 年，德国拜耳公司研制出环丙沙星，成为目前Z有效的氟喹诺酮类药物。它是一种广谱抗生素，用于ZL多种细菌感染。研究文献提出使用 C18 HPLC 色谱柱。然而，由于环丙沙星含芳香族官能团，因此非常适合应用苯基固定相。本应用简报介绍了采用 Quasar 联苯色谱柱分析合成抗生素环丙沙星。

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