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导读

尽管各国卫生系统发展迅速，但由病原菌引起的传染病仍然是人类健康的主要威胁之一。据报道，全世界每年有220多万人死于水传播大肠杆菌病原体。尽管大多数大肠菌群是无害的，但某些大肠杆菌的存在可能会导致甚至威胁到人类健康，例如，大肠杆菌O157:H7和其他产志贺毒素的大肠杆菌菌株（非O157 STEC）是食源性疾病的常见因素，可能对健康造成严重后果，尤其是对幼儿。因此，检测大肠杆菌对于生物医学应用以及食品、水和空气质量监测非常重要。

大连理工大学环境科学与技术学院，工业生态学与环境工程教育部重点实验室的科学家，开发出基于naica®全自动微滴芯片数字PCR系统的单细菌检测方法，该方法可以在1.5小时内以单细胞灵敏度选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌 。该方法发表在《Analytical Methods》，题为“Single bacteria detection by droplet DNAzyme-coupled rolling circle amplification”。

应用亮点：

▶  dDRCA系统，能够快速、选择性地检测具有单细胞敏感性的大肠杆菌 ，dDRCA系统的检测灵敏度比之前报道的PAD高1000倍。

▶ 证明了dDRCA系统在尿路感染诊断中的潜在临床适用性，dDRCA能够在不到1.5小时内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。

文中采用naica️®全自动微滴芯片数字PCR系统液滴微流控技术，快速精准的检测到复杂样本和高背景样本中的致病大肠杆菌。

通常扩增需要约4小时进行定量大肠杆菌检测。在这项研究中，我们描述了DNA酶偶联滚圈扩增（RCA），这是一种高效的等温酶DNA复制过程，可在naica️®全自动微滴芯片数字PCR系统上进行，以建立液滴DNA酶偶联RCA（表示为dDRCA）系统。我们进一步证明，该系统能够在1.5小时内以单细胞敏感性选择性检测临床尿液样本中的大肠杆菌。

▲图2（a）通过琼脂糖凝胶电泳分析RCA产物（RP）。（b） 反应混合物在指示反应条件下的荧光响应：+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (blue line);  RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli (green line);  RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (red line); + RFD-EC1/+ RDS/-E. coli (pink line)。（c） Naica Prism3阅读器图像（左）、CLSM图像（中）和荧光显微镜图像（右）为微晶芯片液滴的大小。比例尺：1.4 mm（左）和100 mm（中、右）。指示反应条件下dDRCA系统的荧光图像和荧光滴数：（d）+RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli;（e）-RFD-EC1/+ RDS/+ E. coli; (f) -RFD-EC1/+ RDS/  E. coli; (g) + RFD-EC1/+ RDS/  E. coli.

使用Naica Prism3阅读器对生成的荧光液滴进行成像和分析。dDRCA系统能够在75分钟内选择性计数具有单细胞敏感性的大肠杆菌，包括20分钟的细胞裂解时间、12分钟的液滴生成时间和43分钟的液滴反应时间。

通过比较其他三种常见细菌，包括枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、酸性乳片球菌（P.acidilactici）和唐菖蒲伯克霍尔德菌（B.gladioli）存在时的信号反应，也检查了dDRCA检测大肠杆菌的选择性。当用缓冲液或尿液中的这些意外靶点测试每个dDRCA系统时，未观察到明显的荧光液滴（图4c和S4†）。

▲图4（a）不同大肠杆菌浓度（每毫升细胞数）下dDRCA反应的荧光图像。比例尺：1.4 mm。（b） 不同浓度下计数的液滴数与大肠杆菌之间的关系。提供了计数的液滴数量，插图显示了1–104大肠杆菌范围内的线性反应。误差条代表三个独立实验的标准偏差。（c） dDRCA的特异性。

最终证明了dDRCA系统在尿路感染（UTI）诊断中的潜在临床适用性。分析了20份患者和健康献血者的临床尿样。整个操作程序包括：（1）细胞收集和裂解（25分钟）；（2） 液滴生成（12分钟）；（3） 液滴反应（43分钟）。如图5c所示，五个尿样，即ID 6、8、9、12和14，比其他尿样产生大量荧光液滴（>3000）。使用传统的大肠杆菌培养方法进一步确认了这些有无大肠杆菌感染的样本（图5d）。因此，对UTI的诊断有很大的希望。

▲图5（a）检测尿液样本中的大肠杆菌。（b） 显示尿液样本中计数数与大肠杆菌细胞在1-104范围内的线性相关性的曲线图。（c） 20份临床尿液样本中阳性液滴的数量。（d） CLED（胱氨酸、乳糖电解质缺乏）琼脂细菌尿液培养板。黄色菌落代表大肠杆菌在37℃的CLED琼脂中培养22小时后的生长。

该系统能够在不到1.5小时的分析时间内，从20份临床尿液样本中成功识别出5名UTI患者，而传统的基于培养的方法需要数小时。

naica®六通道数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读

反刍动物是指具有反刍习性的一类哺乳动物，如牛、羊、长颈鹿、兔子等。反刍动物采食一般比较匆忙，大部分未经充分咀嚼就吞咽进入瘤胃，经过瘤胃浸泡和软化一段时间后，食物经逆呕重新回到口腔，经过再咀嚼混入唾液并再吞咽进入瘤胃，这种行为称为反刍行为。反刍动物的食物种类比其他种类的动物更丰富，结构组成也更复杂，但草料中的粗纤维含量较高导致其难以消化，反刍动物依赖于胃部微生物群的代谢能力来消化各种物质，但其转化效率低也是养殖业广泛关注的问题。

虽然已有研究证明瘤胃中不同微生物的活性可以调节宿主利用植物生物能量的能力，但定植于宿主瘤胃中的微生物却很少受到关注。奥地利维也纳兽医大学的Cameron等人在Research Square在线发表了题为《Differential partitioning of key carbon substrates at the rumen wall by recently diverged Campylobacteraceae populations》的研究论文。文章采用多重数字PCR（dPCR）量化同一菌科的两种菌群，分析反刍动物瘤胃上的定植菌群分布及生物进化动态，为今后畜牧业提高动物代谢能力的研究提供了新思路。

应用亮点：

▶  宏基因组测序发现瘤胃上皮细胞中弯曲杆菌科两个种群的基因序列高度相似，利用naica®微滴芯片数字PCR系统可以对两个种群进行精准量化。

▶ 使用不同培养添加物后，可以利用naica®微滴芯片数字PCR系统进行微生物种群分布跟踪。

研究成果：

作者通过对瘤胃上皮微生物组的16S rRNA扩增子分析发现了一个优势菌株（OTU）为弯曲杆菌科（Campylobacteraceae），并通过宏基因组测序发现该OTU两个主要种群Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi的基因含量高度相似，但pgl（蛋白质糖基化）操纵子不同。

为了探究Ca. C. stinkeris与Ca. C. noahi两个种群空间分布的差异，作者通过naica^®微滴芯片数字PCR系统比较了这两个种群在不同动物瘤胃乳突离上皮壁最近和最远两个位置的含量。结果发现不同动物的两个种群在这两个位置的比例接近。

▲图1 Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突顶端和隐窝的含量比例。A）从乳突切片两个位置提取DNA使用dPCR进行定量分析。B) Ca. C. stinkeris 和Ca. C. noahi在动物瘤胃乳突两个位置的含量比例。横坐标为取样动物的名字。

然后作者使用naica^®微滴芯片数字PCR系统对两种菌群进行生长和适应性测定，数据显示Ca. C. stinkeris可以在以醋酸盐为主要碳源时积累的生物量，更好地生长，但被丙酸盐抑制，而Ca. C. noahiz在任何一种添加物存在的情况下在都没有检测到生长优势。因此，作者推断可能存在一些其他机制来最小化竞争，这种机制通过某些代谢生态位维度上的分化，防止它们生长动力学的重叠来支持两个种群的共存。

▲图2 醋酸盐利用和丙酸盐抗性检测。A)通过种群特异性dPCR，评估添加5 mM醋酸盐（acetate）或丙酸盐（propionate）对生物量积累的影响。分别用单个菌株(左，单一培养)和竞争菌株(右，共培养)进行了实验。

通过数字PCR这种定量技术，作者发现在瘤胃乳突的顶端和隐窝都分布有这两种优势菌群，且与上皮细胞分布数目无显著的相关性。另外，这两种菌群能够促进相关脂肪酸的代谢，进而发挥促进食物消化的功能。该文章为通过调节反刍动物体内某些盐离子浓度来调节优势菌群的分布比例进而提升消化能力提供了思路。

导读

中国疾病预防控制中心国家病毒病预防控制研究所和中国首都儿科研究所的科学家在Canadian Journal of Infectious Diseases and Medical Microbiology上发表了题为The Viral Load of Human Cytomegalovirus Infection in Children following Hematopoietic Stem Cell Transplant by Chip Digital PCR的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统建立了芯片数字PCR（cdPCR）方法，能够精准定量HSCT前后儿童HCMV感染的病毒载量。质粒pUC57-UL83的cdPCR检测限为103拷贝/ml，qPCR检测限为297拷贝/ml。cdPCR检测HCMV AD169毒株的结果为146拷贝/ml，表明cdPCR的灵敏度高于qPCR。

人类巨细胞病毒（HCMV）是一种普遍存在的β-疱疹病毒，已感染发展中国家高达90%的人口。作为一种常见病原体，HCMV感染在免疫抑制个体中引起了显著的发病率和死亡率，特别是在接受了造血干细胞移植（HSCT）的患者中，原因是原发感染后潜伏感染的主要靶细胞是造血细胞。对于HSCT后的高危儿童，应在出现临床症状之前检测HCMV感染，因为HCMV病毒的载量及变化与HSCT儿童HCMV感染的发展和严重程度高度相关。因此，HCMV病毒载量的定量检测对患儿的治疗至关重要。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统开发了一种快速、直观、简便和准确的检测HSCT前后儿童HCMV病毒的绝对定量方法。

▶ 通过质粒和培养毒株验证naica®微滴芯片数字PCR系统灵敏度、特异性和重复性。

实验方法：

作者从首都儿科研究所儿童医院收集了122名异体造血干细胞移植患儿、3名自体造血干细胞移植患儿样本（男/女:73/52），中位年龄7.5岁。该研究通过质粒和培养毒株验证naica®微滴芯片数字PCR系统灵敏度、特异性和重复性均优于qPCR。在HSCT前后，通过qPCR和cdPCR检测所有供体和受体血清中的HCMV病毒载量。

实验结果：

作者通过含有pUC57-UL83基因的质粒DNA分别评估cdPCR和qPCR的动态范围。cdPCR的检测限 (LOD) 为103拷贝/ml (2.0拷贝/反应)，qPCR的LOD为297拷贝/ml。结果表明，cdPCR的灵敏度高于qPCR。

为了评估cdPCR数据的重现性，作者使用质粒建立了HCMV DNA拷贝数的标准曲线。分析cdPCR检测的变异系数（CV、标准差/平均值）。结果表明，cdPCR检测具有良好的重复性（CV<15%）。稀释质粒的预期值与cdPCR检测值之间也具有良好的一致性（cdPCR检测值与稀释质粒的预期值R= 0.979, P< 0.05， qPCR检测值与稀释质粒的预期值R= 0.939, P< 0.05）。

▲图1 通过标准曲线评估cdPCR检测的HCMV DNA拷贝数的变化。黑线显示质粒DNA的标准曲线。不同的散点是通过cdPCR测试到的HCMV DNA拷贝数。

作者又使用HCMV AD169毒株验证cdPCR的灵敏度。qPCR可以检测到5.67×10 TCID50/ml HCMV DNA，但不能检测到5.67 TCID50/ml HCMV DNA。cdPCR可以检测5.67 TCID50/ml病毒的HCMV DNA。cdPCR的灵敏度优于qPCR。

为了验证cdPCR方法的敏感性以及是否可以用于HSCT患者血液中的HCMV检测，作者通过qPCR和cdPCR检测了125例HSCT后儿童的全血样本。在38份cdPCR阳性样本中，有4份qPCR阴性样本。在91份qPCR阴性样本中，有4份cdPCR阳性。结果如表1所示。

HCMV在125个HSCT患儿的检出率为30.40% (38/125)，HCMV病毒载量范围为107拷贝/ml-6600拷贝/ml。男性组的检出率为30.14% (22/73)，女性组的检出率为30.77% (16/52)。在0-12岁HSCT后HCMV阳性儿童中，HCMV的检出率为89.47% (34/38)。在0-6岁组中，男性的检出率为25.64% (10/39)，女性的检出率为22.58% (7/31)。在7-12岁组中，男性的检出率为39.29% (11/28)，女性的检出率为40% (6/15)。12岁以上患儿HCMV检出率为33.33% (4/12)，男性检出率为16.67% (1/6)，女性检出率为50% (3/6)。结果如表3所示。

综上所述， cdPCR方法在HCMV检测领域比qPCR更敏感，能快速、直观、简便和准确的检测HSCT患儿HCMV感染率及病毒载量。

参考文献：

1.P. Griffiffiffiths, I. Baraniak, and M. Reeves, “,e pathogenesis of human cytomegalovirus,” Journal of Pathology, vol. 235, no. 2, pp. 288–297, 2015.

2.L. Dupont and M. B. Reeves, “Cytomegalovirus latency and reactivation: recent insights into an age old problem,” Reviews in Medical Virology, vol. 26, no. 2, pp. 75–89, 2016.

naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

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自2019年底新冠肺炎疫情爆发以来，已经在人类粪便和城市废水中广泛检测到SARS-CoV-2。新冠病人的粪便可以重复检测到SARS-CoV-2 RNA（有时甚至在呼吸道样本已经检测不到的情况下），并且与疾病的临床严重程度无关。在多个国家的城市废水中也广泛检测到SARS-CoV2 RNA，但检测到的浓度比人的粪便低几个数量级。未经处理的废水中SARS-CoV-2 RNA的存在导致了基于废水的流行病学（WBE）的发展，以早期检测社区新型冠状病毒肺炎的传播，这也引起了人们对废水处理(WWT)过程尤其是在其终产物WWT污泥中SARS-CoV-2的命运以及相关风险的关注。

法国巴黎地区跨省废水处理工会(SIAAP)和巴黎萨克莱大学的科学家在Environmental Research发表了题为Fate of SARS-CoV-2 coronavirus in wastewater treatment sludge during storage and thermophilic anaerobic digestion的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统对WWT污泥中SARS-CoV-2进行绝对定量，为持续监测WWT污泥中的新冠病毒载量提供了具有应用价值的检测方法。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统开发了一种快速、直观、简便的WWT污泥中SARS-CoV-2绝对定量的方法。

▶ naica®微滴芯片数字PCR系统可以实时监测高热厌氧消化后WWT污泥中SARS-CoV-2载量，不受抑制剂影响，特别适合低浓度，低丰度样本。

实验方法：

作者采集了不同的废水处理厂的新鲜污泥，研究WWT污泥在储存 (4℃、室温) 或高热厌氧（AD）消化 （50℃）后SARS-CoV-2稳定性。部分污泥中掺入了新型冠状病毒肺炎患者中分离出的SARS-CoV-2颗粒和/或BCoV（牛冠状病毒）作为加标对照。作者通过RT-qPCR测定了新鲜WWT污泥在4℃和室温条件下SARS-CoV-2颗粒RNA的载量。为了降低可能含有的PCR抑制剂对样品中SARS-CoV-2检测的影响，作者使用灵敏度更高的naica®微滴芯片数字PCR系统，持续监测高热厌氧消化5天过程中SARS-CoV-2颗粒的RNA水平。

实验结果：

新鲜WWT污泥在4℃ 55天和20℃左右环境温度25天储存条件下SARS-CoV-2颗粒的RNA的载量维持在一个相对稳定的水平。但在高热厌氧消化过程中，SARS-CoV-2和BCoV RNA水平迅速下降，持续5天处理后最终水平接近检测极限。

▲图1  部分污泥中掺入了新型冠状病毒肺炎患者中分离出的SARS-CoV-2颗粒和/或BCoV（牛冠状病毒）作为加标对照。该图展示了加标或未加标的新鲜 WWT 污泥在高热厌氧消化过程中SARS-CoV-2和BCoV RNA 水平的动态变化。为了降低可能含有的PCR抑制剂对样品中SARS-CoV-2检测的影响，作者使用抑制剂耐受能力更佳的naica®微滴芯片数字PCR系统来检测高热厌氧消化过程中的SARS-CoV-2水平。GU/g:厌氧消化反应器样品中每克含有的基因组单位。

期刊介绍：

Environmental Research创刊于1967年，隶属于爱思唯尔出版集团。该杂志的主要发表评估化学品和微生物污染对人类健康影响的文章，2022年影响因子8.431，JCR分区为Q1。

参考文献：

1.Adelodun B, Kumar P, Odey G, et al. A safe haven of SARS-CoV-2 in the environment: prevalence and potential transmission risks in the effluent, sludge, and biosolids. Geosci, 2022, 101373.

2.Ahmed W, Bertsch P M, Bibby K, et al. Decay of SARS-CoV-2 and surrogate murine hepatitis virus RNA in untreated wastewater to inform application in wastewater-based epidemiology. Environ, 2020a, 191, 110092.

导读

在过去的几十年中，糖尿病的发病率在显著增长。除了不健康的生活方式外，环境污染物被认为是糖尿病发生的危险因素。多环芳烃 (PAH)是一类含有2-7个芳环的有机化合物，由自然和人类活动产生并广泛存在的污染物。流行病学研究表明，PAHs水平与成人和儿童的肥胖和二型糖尿病相关。

厦门大学生命科学学院细胞应激生物学国家重点实验室的研究人员在Ecotoxicology and Environmental Safety上发表了题为《Prenatal exposure to a mixture of PAHs causes the dysfunction of islet cells in adult male mice: Association with type 1 diabetes mellitus》的文章。文中应用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因DNA甲基化水平进行量化，揭示了产前暴露于多环芳烃混合物对成年雄性小鼠胰岛细胞功能的不良影响。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统对胰岛素编码基因启动子甲基化水平进行量化。

▶ 在产前暴露于500µg/kg PAHs的小鼠中，胰岛素编码基因启动子的甲基化水平显著升高。

▶ 产前暴露于PAHs可能促进I型糖尿病的发病。

作者使用8种PAHs的混合物进行了实验，以研究产前PAHs对成年期胰岛细胞功能和质量的影响，同时试图阐明 I型糖尿病发病的环境原因。他们分离了成年雄性小鼠的胰岛，对胰岛素编码基因的启动子DNA甲基化水平进行分析。

研究成果：

▲图1. 产前暴露于多环芳烃对成年雄性小鼠胰岛素编码基因甲基化水平的影响。(A) 数字PCR结果代表性一维图。(B)胰岛素编码基因启动子甲基化水平。(每个处理三只母鼠, 每只母鼠取一个雄性后代) 。

在本研究中，子宫内暴露于500µg/kg PAHs的小鼠胰岛中胰岛素编码基因启动子中的DNA甲基化水平显著增加，同时胰岛素编码基因转录显著下调。

▲图2. 不同PAHs浓度对胰岛素编码基因转录水平的影响

期刊介绍：

Ecotoxicology and Environmental Safety 1977创刊，隶属于爱思唯尔出版集团。是一份多学科交叉期刊，主要研究环境污染对包括人类健康在内的生物体的暴露和影响。最新影响因子为7.129。

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法国Stilla Technologies公司naica®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的绝对拷贝数浓度。

导读

除了在蛋白质翻译中的作用外，tRNA可以被切割成较短的生物活性片段，称为tRNA片段（tRFs）。来自精细胞的特定tRFs可以引起第二代小鼠中代谢紊乱。因此，种系细胞中的tRFs是表观遗传的一种机制，然而压力和毒素会导致tRFs模式的改变。华盛顿大学妇产科临床研究部的研究人员在MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION上发表题为《Men who inject opioids exhibit altered tRNA-Gly-GCC isoforms in semen》的文章。本研究对注射类药物（一个重要的压力源）是否会影响生殖细胞中的tRFs感兴趣。研究者对来自注射阿pian类药物病人(PWID)和非药物使用对照组精液来源外泌体及精母细胞进行了RNA测序。测序后采用naica^®微滴芯片数字PCR技术验证数据，该技术的应用为药物滥用相关生育问题的研究提供了新的策略和方法。

阿pian药物滥用对生殖系统的影响一直备受关注。近期一项研究揭示了注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体的变化。该研究通过数字PCR技术检测tRNA-Gly-GCC外泌体，发现未注射阿pian类药物的男性与注射阿pian类药物的男性精液中tRNA-Gly-GCC外泌体存在显著差异。

tRNA-Gly-GCC外泌体在精子发生和成熟过程中扮演关键角色。研究结果表明，这些差异可能与精子质量和生育能力的下降有关。naica^®微滴芯片数字PCR技术在本研究中的应用，不仅提供了高灵敏度和高准确性的检测方法，对揭示阿pian类药物对生殖系统的影响具有重要意义。

应用亮点：

▶  naica^®微滴芯片数字PCR技术可以在RNA浓度低于检测下限的样品中检测两种tRFs形式。

▶ naica^®微滴芯片数字PCR结果与RNA测序结果具有很好的相关性，但比测序具有更高的灵敏度和准确性，有助于深入了解长期使用阿pian类药物的生物学影响。

研究结果：

▲图１.男性长期使用阿pian类药物导致精子中tRF-Gly亚型比例的变化,使用naica^®微滴芯片数字PCR技术定量tRFs。成熟精子细胞通过45-90% Percoll梯度纯化，并使用核苷素试剂盒分离小RNA。cDNA使用一种特定的茎环RT引物与“长”tsRNA亚型（53个核苷酸长）或另一种靶向“短”tsRNA变体（32个核苷酸长）的特定RT引物生成。（A）每微升cDNA中“长”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（B）每微升cDNA中“短”tRF Gly-GCC亚型的浓度。（C）“长”与“短”tRF Gly-GCC亚型的比例。（D）每微升cDNA中miR100-5p的浓度。“C”：对照组（不注射药品的男性）;“PWID”：阿pian药物注射组。P值通过单尾曼-惠特尼U检验计算。对照组：n=10，PWID组：n=13。

研究发现，对照组中超过90%的reads到较短的Gly-GCC tRF，而在PWID中只有45%的读数。相比之下，对照组中只有4.1%的reads到更长的tRF，而PWID为45.6%。PWID的长/短tRF比显著高于对照组。同时发现精液来源的外泌体中小核仁RNA（snoRNA）表达差异。尽管无法确立PWID的发现与阿pian类药物使用之间的直接联系，但研究表明阿pian类药物注射和/或相关多药使用习惯和生活方式改变可能会影响表观遗传。这为阿pian类药物使用的可遗传影响提供了证据，并为进一步研究其跨代健康影响的机制奠定了基础。

数字PCR技术在研究PWID中差异表达的tRFs方面发挥了重要作用。由于精液中含有复杂的细胞混合物，意味着其中含有抑制剂，对于PCR的扩增有很大影响。但数字PCR有抗抑制剂干扰的特点，所以对于这类复杂样本的检测更为适用。文章中数字PCR和测序各自发挥了作用：测序用于发现长tRF和短tRF，而数字PCR则准确检测了tRF片段的表达差异，进而验证了测序的结果。这一发现表明，数字PCR在研究tRFs和其他非编码RNA片段方面具有显著的优势。数字PCR不仅可以在tRFs和其他类似的研究中提供更为精确的结果，还可以在诸如癌症、遗传学和传染病等领域发挥关键作用。

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法国Stilla Technologies公司naica^®六通道数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的juedui拷贝数浓度。

导读

西瓜 (Citrullus lanatus, 2n=22)是世界第三大水果，是世界各地种植的重要经济作物，也是一种受欢迎的新鲜水果，含有糖、番茄红素和瓜氨酸等有益人体健康的化合物。研究人员通过杂交开发了大量西瓜品种以满足消费者的偏好。但长期栽培和对果实品质性状的筛选，不同地理区域采集的栽培西瓜显示出较低的遗传多样性，因此需要更多的遗传种质资源用于可持续生产西瓜的创新品种。

参考基因组对于性状和基因发现是必不可少的。西瓜基因组测序工作始于十几年前。除西瓜基因组初稿外，自2019年以来已经发布了三个高质量的西瓜参考基因组。然而，每个基因组仍然不完整，存在许多空白。高质量的参考基因组与从相同遗传库产生的突变体数据相结合，将有助于发现和分离遗传和育种所需的突变体。无缺口参考基因组是基因组组装的最终目标，为识别“暗物质”区域中的独特基因和结构变异带来了新的机会。

北京大学高等农业科学研究所科研人员在Molecular Plant（JCR分区Q1，影响因子21.9496）上发表了题为《A telomere-to-telomere gap-free reference genome of watermelon and its mutation library provide important resources for gene discovery and breeding》的文章。研究者使用西瓜优良近交系G42组装了一个T2T（telomere-to-telomere）无缺口参考基因组，弥补了当前可用参考基因组中所有剩余的组装缺口。通过基因组信息比对识别了甜西瓜种质中一个包含ClTST2（液泡膜糖转运蛋白）基因的17.5 kb串联重复序列(sv04611)。该研究应用naica^®微滴芯片数字PCR系统对西瓜CITST2基因的拷贝数进行检测，证实了不同西瓜种质之间CITST2基因拷贝数存在差异，甜西瓜种质中CITST2基因的拷贝数增加可能是造成糖含量增加的原因。

应用亮点：

▶  使用naica^®微滴芯片数字PCR系统对甜西瓜和不甜西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异进行准确定量。

▶ 甜西瓜和不甜西瓜种质中CITST2基因分别为两个拷贝和单个拷贝。

▶ CITST2基因的拷贝数变异可能会改变西瓜糖含量。

G42基因组组装比其他参考基因组组装具有更高的完整性和准确性，为更准确地描述基因结构变异（SVs）提供了更多的数据支撑。数字PCR技术已被证明可以灵敏可靠地检测拷贝数变异的核酸绝对定量工具。该研究采用naica^®微滴芯片数字PCR系统精确定量不同西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异，验证了无缺口参考基因组识别SVs的准确性。

研究成果：

本研究成功组装出G42 西瓜的T2T无缺口参考参考基因组，包括所有22个端粒和11个着丝粒的信息。利用无缺口参考基因组数据，研究者识别了甜西瓜种质（97103和G42）sv04986结构中一个包含ClTST2基因的17.5 kb串联重复序列(sv04611)。这是不甜西瓜种质（PI 595203和PI 296341-FR）基因组中不存在的。ClTST2基因编码一种定位于液泡的糖转运蛋白，其表达与西瓜果肉中的糖积累呈正相关。

▲图1. (A)sv04986 结构在甜西瓜（97103和 G42）和不甜西瓜（PI 595203和PI 296341-FR）种质中含有 ClTST2 基因。甜西瓜种质中存在一个17.5kb的串联重复序列sv04611，包含2bp的CA插入突变。红色箭头代表引物 ClTST2-R8/ClTST2-F3的位置。(B)使用ClTST2-R8/ ClTST2 -F3 引物扩增四个西瓜种质DNA 样本的结果。

随后作者使用naica^®微滴芯片数字PCR系统对甜西瓜和非甜西瓜种质之间CITST2基因拷贝数的差异进行了准确定量。FAM通道仅能检测到存在CA插入突变的区域。HEX通道用于检测ClTST2基因。CY5通道检测的是西瓜中的单拷贝内参基因Actin。当CITST2基因为双拷贝时，FAM/HEX/CY5拷贝数比约为1:2:1。当CITST2基因为单拷贝时，FAM/HEX/CY5拷贝数比约为0:1:1。数据显示两个不甜西瓜的种质仅包含单拷贝CITST2基因，而甜西瓜种质在包含两个拷贝CITST2基因。

▲表1.利用dPCR技术估算甜和不甜西瓜种质中CITST2基因拷贝数

期刊介绍：

Molecular Plant (《分子植物》)是由中科院上海生命科学研究院植物生理生态研究所（IPPE）与中国植物生理与植物分子生物学学会（CSPP）主办，中科院上海生命科学信息中心生命科学期刊社承办的学术期刊，创刊于2008年。2022最新JCR分区Q1，影响因子21.9496。

多重分析，即在单个反应中检测多个靶标，可以帮助用户节省宝贵的样品，并节省时间、试剂和成本。此外，和做多次单重实验相比，由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测，使得样品和试剂的移液操作误差减少，因此多重检测可以提高定量精度。naica®微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和JZ。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测，从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件，可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。

评估引物和探针性能的实验指南

1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix，该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica®微滴芯片数字PCR系统的实验数据。

2.单重反应测试。在进行多重反应之前，每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如，对于三重分析，在多重反应混合进行之前，首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时，预期结果只出现单一阳性。

3.为了优化多重分析性能，样品性质也是十分重要的因素(例如，游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段，分析游离DNA需要设计成短片段DNA，分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。

4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的YZ剂。如果样品材料稀少或不容易获得，可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。

5. 评估每个单重反应的退火温度范围，在ZJ反应温度下，阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准，用于确定所有探针的ZJ退火温度。如果单重反应没有被很好地优化，可能会出现明显的非特异性扩增。此外，非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下，可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增，如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。

▲图1 ：Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图，在60°C到65°C退火温度内， 蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的ZJ退火温度。可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的ZJ退火温度。(带*数字为可分性评分)

▲图2 ：可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是

由Crystal Miner软件自动计算，并可以在高级QC标签栏下找到。

6.在选定的退火温度下，使用所有引物和探针进行多重naica®微滴芯片数字PCR系统，并以区分度为指导，评估反应性能。如果有需要，可从以下几点优化:

★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始，并增加循环数，以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。

★ 调整引物和探针浓度——naica®微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。

▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)

浓度不断增加时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分，

及在低引物探针浓度的选择标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)

★ 使用修饰的碱基，如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB)，以提高探针的Tm值，同时保持较短的长度(可能<20nt)。然而，在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个，以避免扩增减少。

7.评价引物和探针的相互作用：在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在ZD。二聚体是可以评估的，相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如，IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此，多重分析时，建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如，0.25 uM)，如果需要，逐步增加浓度至1 uM(例如，提高扩增效率)。

▲图4：引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物相互作用(R2 target 2，红框)。当使用反向引物RI target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。当使用正向引物F1 target 2时，没有检测到这种相互作用。在本例中，FI target 2应被选择用于多重检测。

8.对于多重分析，荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照，Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。

naica®微滴芯片数字PCR系统

naica®微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成25,000-30,000个微滴的2D阵列，以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测，从而对起始核酸浓度进行JD定量。2.5小时内，可快速获得结果。

线粒体疾病是线粒体基因组（mtDNA）发生基因突变所导致的一类遗传疾病, 仅通过雌性种系传播。通常，细胞中超过60%的线粒体DNA发生突变就会导致疾病，并且一个人的线粒体DNA突变越多，其疾病就越严重，线粒体疾病目前是不可治愈的。

▲图源：网络（侵删）

目前核移植（NT），也称为线粒体捐赠，作为一种预防线粒体疾病从患病母亲传给其后代的战略而受到了越来越多的关注。但由于核移植中含有少量细胞质来源的mtDNA，介导受体中mtDNA异质性改变且伴有扩增，因此需要对mtDNA突变负荷进行准确定量，现用NGS测序方法局限性在于成本较高、耗时较长、数据处理复杂且信噪比较低。

Leber遗传性视神经病（LHON）最常见的母系遗传性线粒体疾病，比利时根特大学生物系专家团利用数字PCR(dPCR)平台对LHON相关m.11778 G＞A突变位点进行检测，并和NGS方法进行对比，探讨数字PCR在mtDNA异质性定量中的适用性。研究成果发表在知名期刊《Clinical Chemistry》上。

检测样本信息:

为了评估dPCR在异质性评估中的适用性，共设置了3种类型的样品：（i）具有很高突变负荷的患者样品13个；（ii）由健康志愿者捐赠的同质野生型样品3个；（iii）经过NT处理的样品，由于mtDNA残留而携带低突变负荷，共6个样本。

检测方法：

通过处理，将样品突变负荷范围设置在50％至0.01％，进行分析验证。

实验结论:

☑  在dPCR和NGS结果上观察到的突变率具有良好的一致性。

☑与NGS相比，dPCR具有更低的背景噪声。使用naica®微滴芯片数字PCR系统，非患者样本中的突变等位基因没有阳性信号，符合预期。

☑  和dPCR结果相比，在NGS结果中几乎所有异质样品的次要等位基因频率都被高估，初步猜测NGS实验流程中可能引入了错误序列，经过PCR扩增改变次要等位基因频率。

☑  相较于NGS，数字PCR成本低、操作简便、结果直观、更适用于低频突变检测。

☑  数字PCR方法适合用于核移植后线粒体异质性定量检测。

▲naica®微滴芯片数字PCR系统检测不同mtDNA样本二维图（FAM-突变型，VIC-野生型）

左上：高突变负荷患者样本；右上：野生型样本；左下：NT后异质性样本；右下：NTC

▲Bland-Altman PLOT评估naica®微滴芯片数字PCR系统检测结果和NGS结果的一致性

文章conclusion给出-数字PCR具有更多优势，适用于核移植后线粒体的异质性评估：

▲ 图片来源：原文第8页

期刊介绍：

naica®微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的JD拷贝数浓度。

导读

据报道，截至目前两台“奶茶“Naica全自动微滴芯片式数字PCR系统正式在上海交大落户啦-上海交通大学生物医学工程学院和上海交通大学分析测试ZX，感谢上海交大各位老师们的大力支持，顺利完成安装培训并启用！

不需要标准品可以对低拷贝基因定量，对微小差异的基因进行分析，对含YZ剂的样本进行准确定量等，弥补了二代PCR技术也就是荧光PCR的不足。目前数字PCR技术已经应用在肿瘤学研究、NIPT研究、液态活检、基因编辑、细胞ZL质控、用药及移植监控、致病微生物检测、食品安全、环境检测、核酸类标准物质定量等方面。

此次“奶茶”Naica系统的顺利使用支持其科研团队在分子与纳米医学领域，聚焦重大临床早期诊断和疾病预后等专项科研成果的转化医学研究，攻克关键技术难题，推进 “产学研医”有机结合的科技成果产业化进程。

“奶茶”Naica系统的落户可为核酸定量、生物医学研究、水质检测、食品检测、转基因成分检测、环境污染物分析等多方面检测提供更可靠的平台。

非常感谢用户对我们的平台的认可，同时也希望”奶茶“Naica全自动微滴芯片数字PCR为越来越多的用户检测提供更便捷，更可靠的技术。

更多“奶茶“Naica数字PCR信息可登陆www.cycloudbio.com查看。同时由法国Stilla Technologies公司开发Gene-π作为数字PCR学习交流平台，为您全方位解读数字PCR技术，为用户提供数字PCR技术信息，您也可以选择感兴趣的应用教程，其中包含从实验设计到数据分析的详细工作流程。您还可以通过搜索导航工具直接搜索特定的项目（"dPCR的DNA准备"，"荧光溢出"等），或点击我们的"HOW TO" 选择您需要的部分（设计、分析、报告）。详细信息可登陆网站：https://www.gene-pi.com/查看。

在现代水产养殖中，水产养殖系统的水质直接影响鱼类的健康和生产。微生物在去除有机物和氮循环、有毒硫化氢(H2S)的产生方面发挥着至关重要的作用，但是如果微生物对鱼类致病或发挥益生菌特性，则会直接影响鱼类的健康。

近日，法国Stilla公司和挪威SINTEF Ocean合作在《Journal of Microbiological Methods》杂志上发表了一篇名为“Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR”的文章，旨在对水产养殖的相关优势细菌进行检测。

在本文中，作者主要分析了与鲑鱼生产相关的三种不同的细菌：

一种为鱼类病原体，与鱼类的溃疡性疾病有关的Moritella viscosa，会引起肠性红嘴病的Yersinia ruckeri以及与鱼类的细菌性冷水病有关的Flavobacterium psychrophilum。

二种为可以从海产品转移到消费者身上的人类病原体，Listeria monocytogenes。

三种为通过破坏饲养环境威胁鱼类健康的细菌。通常硫酸盐还原细菌（SRB）在厌氧条件下通过将硫酸盐（SO42-）转化为有毒的硫化氢（H2S）来影响鱼类健康。可通过以Desulfovibrio desulfuricans为参考菌株进行SRB检测。

研究学者利用naica®微滴芯片数字PCR系统的单重和多重检测方式对上述优势菌种进行JD定量。结果表明Moritella viscosa， Yersinia ruckeri，Flavobacterium psychrophilum检出限在20 fg左右，Listeria monocytogenes和Desulfovibrio desulfuricans DNA检测含量可低至2 fg，同时它们都具有较高的线性动态范围（图1）。多重cdPCR检测结果与在相应的单重分析中检测到的目标基因浓度非常吻合（图2，图3）。此次试验充分证明了naica®微滴芯片数字PCR系统可以同时精确定量复杂水质样品中多种优势菌株。

▲图1 ：naica®微滴芯片数字PCR系统定量5种

优势菌种的线性回归图，分别给出相应的方程和回归系数

▲图2：对Yersinia ruckeri（A）Flavobacterium psychrophilum（B）的单、双重分析结果进行比较。

在MMC-DNA背景(1 ng/μl)中添加Yersinia ruckeri ，Flavobacterium psychrophilum gDNA，10倍稀释后进行基因拷贝数定量。

▲图3 ：在1 ng/μl MMC-DNA背景下，单重(圆形)和三重(三角形)测定的靶基因拷贝浓度绘制。

恒等线表示每个点的X坐标和y坐标相等的位置。

文章基于naica®微滴芯片数字PCR系统完成对多种优势菌株的定量检测。

naica®微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司的naica®微滴芯片数字PCR系统在进行核酸检测时具有独特的优势。该系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要两个半小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

naica®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的JD拷贝数浓度。

导读

韩牛（Bos taurus coreanae）是一种驯化的哺乳动物，在韩国消费市场作为食物资源，其牛肉消费量远超其他品种，这种消费模式导致了区分韩牛和其他牛品种的分子研究的出现。不仅是牛，其他经济动物的不同品种在市场中的经济价值也存在较大的差异，所以准确进行种质鉴定势在必行。

在之前的一项研究中，使用传统的PCR方法和Sanger测序验证确定了由TE关联缺失事件产生的韩牛特异性SV。它可以用作区分不同牛品种的分子标记（即韩牛与荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每个样品都有各种最终拷贝定量。为了克服传统PCR的局限性，并准确评估先前研究中确定的韩牛特异性SV位点，檀国大学生物医学科学系联合畜牧研究所和檀国大学医学院，使用naica️®微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV位点进行了更为精确的检测，并将成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》发表在Genomics & Informatics杂志上。

转座元件（TEs）约占牛基因组的一半。它们可以是一个强大的物种特异性标记，在基因组进化时没有结构变异（SV）的回归突变。因此，作者应用naica️®微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV进行准确的定量检测。虽然样品在韩牛群体中的等位基因频率变化较低，但naica️®微滴芯片数字PCR系统可以通过绝对定量进行高灵敏度检测，可以做到比PCR更准确的定量。所以naica️®微滴芯片数字PCR系统平台相比于传统PCR更适用于分子标志物的定量评价。

应用亮点：

▶  使用naica®微滴芯片数字PCR系统对韩牛特异性SV进行准确的定量检测。

▶ dPCR测定在计数单分子和分析特定群体的少量拷贝时可以高精度地定量，与qPCR相比，具有更高的准确性。

▶ 经过sanger测序，确定了naica️®微滴芯片数字PCR系统检测准确无误，且操作和成本均低于测序。

▶ naica️®微滴芯片数字PCR系统适用于分子标志物的定量评价。

实验方法：

检测样本信息：

共提取了五个棕色韩牛DNA和五个荷斯坦DNA作为实验样本。

检测方法：

为了更准确地检测韩牛特异性SV，将“Del_96”位点应用于naica️®微滴芯片数字PCR系统（Stilla Technologies）。进行naica️®微滴芯片数字PCR系统前确认韩牛和荷斯坦牛的DNA的浓度定量。FAM引物组和FAM探针用于检测韩牛和荷斯坦牛基因组。VIC引物组和VIC探针设计在韩牛特异性缺失（图 1B)。因此，FAM引物组和FAM探针（阳性对照）设计在所有牛DNA中检测。VIC引物组和VIC探针设计用于仅检测韩牛的荧光。

▲图 1B

实验结果：

FAM染料在所有牛基因组中均被检测到，VIC染料仅在韩牛样品中显示出显著的检测。这表明所有韩牛基因组都包含特定的缺失序列（Del_96区域）。在韩牛样品中检测到VIC染料的信号平均浓度为243（copies/ μL）。虽然在荷斯坦样品中也检测到平均浓度0.12（copies/μL）的VIC染料信号，但这些信号相比韩牛可忽略不计。

▲naica®微滴芯片数字PCR系统检测韩Del_96和荷斯坦样品之间区域的绝对拷贝数比较。浓度图在 X 轴上指示样品数，在 Y 轴上指示对数刻度条（拷贝/μL）。（A）在所有样品中检测到FAM荧光。韩牛样品的绝对拷贝数大约是荷斯坦样品的两倍。（B）仅在韩牛样品中强烈检测到VIC荧光。

最后，文章Results and Discussion给出-数字PCR适合作为验证物种特异性标记的平台。

综上，对于naica️®微滴芯片数字PCR技术，准确定量绝对拷贝数是一个关键特征，相比qPCR准确性更高，naica®微滴芯片数字PCR为本文的检测提供了有利的支持，也验证了这一特征。在不久的将来，通过将物种识别工具应用于naica️®微滴芯片数字PCR系统，它作为大样本量物种鉴定平台具有巨大潜力。所以naica️®微滴芯片数字PCR系统适合作为验证物种特异性标记的平台。

期刊介绍：

Genomics & Informatics是由韩国基因组组织发行的涉及农业和生物科学、生物化学、遗传学、分子生物学、健康信息学等领域的期刊。

基因调控区的DNA甲基化状态的改变可导致多种癌症的发生。这种表观遗传学改变在生物学上是稳定的，并存在于循环肿瘤DNA（ctDNA）中，使其适合于早期检测和无创动态监测肿瘤负荷。数字PCR技术凭借其较高的灵敏度、jingzhun度以及对YZ剂的耐受度，在对低拷贝样品检测时表现出了极大的优势。

在转移性和II/III期结直肠癌（CRC）患者中，WNTYZ因子1（WIF1）和神经肽T（NPY）的甲基化程度较高，为了评估是否可以使用WIF1和NPY的甲基化程度作为一种结直肠癌标志物，法国Stilla Technologies联合法国国家科学研究ZX（CNRS）、AP-HP等相关单位建立了一种将亚硫酸氢盐法（bisulfite-将未甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶）与数字PCR相结合的方法。

为了检测WIF1和NPY，利用亚硫酸氢盐-3色dPCR检测方法，选择白蛋白基因ALB作为参考基因，测试了从健康个体和CRC患者血浆中提取的ctDNA。并对WIF1和NPY的LOB和LOD进行评估。

3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY

分别检测了10个来自III期或IV期CRC患者和5个健康个体的血浆样品。来自CRC患者的所有血浆DNA样本的高甲基化WIF1和NPY得分均为阳性，而在健康个体中未检测到高甲基化的WIF1和NPY。通过将WIF1和NPY浓度与ALB参考浓度对比评估，血浆DNA中的高甲基化WIF1比例范围为8％至93％，而高甲基化NPY的比例范围为0.1％至78％。血浆样品中检测到的ZD甲基化WIF1和NPY量分别为5.1和1.2cp/μL。

通过上述方法，即经亚硫酸氢盐转化后再进行3色数字PCR方法，能够在每25μL体系中可靠的检测低至25和5个拷贝的高甲基化WIF1和NPY，并且该检测结果可以用作通用的结直肠癌标志物和肿瘤特异性突变的替代物。使用3色Naica Crystal Digital PCR检测WIF1和NPY，结果和理论值一致，未出假阴性和假阳性结果。

Naica数字PCR平台

法国Stilla Technologies公司的Naica数字PCR技术在进行核酸检测时具有独特的优势。系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片作为数字PCR过程的耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要2.5小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

数字PCR学堂

为了方便大家更好的学习数字PCR相关知识，我们为大家提供了Gene-π数字PCR学堂（www.cycloudbio.com数字PCR学堂快速入口），您可以选择感兴趣的应用教程，其中包含从实验设计到数据分析的详细工作流程。您还可以通过搜索导航工具直接搜索特定的项目（"dPCR的DNA准备"，"荧光溢出"等），或点击我们的"HOW TO" 选择您需要的部分（设计、分析、报告）。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。

法国Stilla Technologies公司开发的—款多重PCR专用预混液：naica^®multiplex PCR MIX（见表1），专用于naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的多重检测。并对naica^®multiplex PCR MIX的多重检测性能进行了详细评估。当面对有限的样本量时，可保证多重数字PCR检测的灵敏度和准确性；在复杂背景基因存在的情况下，依然能精确检出低丰度的目的基因。

★ naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的同步准确定量

采用0.2~13000cp/ul的DNA样品，使用10X naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上进行6个靶标的线性范围分析，结果显示6个靶标的R²均＞0.99，说明在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统上，能够可靠地实现6靶标同步准确定量（图1)。与2X和5X浓度的数字PCR预混液(dPCR Mixes)相比，10X浓度的数字PCR预混液体积加入量降低了50％至80％，最大限度地提高样品加入量。尤其是在检测低浓度样品或稀有靶标时，样品加入量的增加可提高检测灵敏度。

▲ 图1：使用naica^®multiplex PCR MIX在naica^®六通道微滴芯片数字PCR上进行6个靶标的线性分析，分别在蓝色、青色、绿色、黄色、红色和红外线6个通道进行检测。每个稀释点的DNA浓度分别为：0.2、1.5、8.0、50、320、2050和13000 cp/ul，每个稀释度进行3次重复。结果显示6个靶标的R2均大于0.99，说明所有靶标的结果都高度真实可靠。

★ 在复杂的背景基因下，对低丰度目的基因进行精确定量

数字PCR的—个重要技术优势是能够在存在多个靶标扩增的情况下检测到低浓度靶标。为了评估naica^®multiplex PCR MIX的稳定性。使用同一个目标DNA模板的不同浓度系列稀释液（0.2~ 13000 cp/uL)进行检测，同时其中掺入5种外部靶标模板（每个靶标的浓度为3000 cp/ul)。在不同测试条件下，结果均呈现良好的线性关系（图2A和2C)。这些结果与同一DNA 靶点在不同浓度下单独检测以及在不添加外部靶标的情况下获得的结果具有可比性（图2B和2D）。

▲ 图2：使用naica^®multiplex PCR MIX的扩增结果真实可靠。将pUC18质粒（图A和B)和pUC57质粒（图C和D)的13000至0.2 cp/ul的系列稀释液在5个外部扩增靶标背景下（每个靶标为3000 cp/ul(A,C)）和在不含外部靶标(B,D)的情况下进行定量检测，3次重复。线性拟合系数 R2>0.99，表明在不考虑多重背景的情况下，对所有靶标的测定结果都是真实可靠的。5个外部靶标的相对标准偏差保持在2.3％至3.1% (n=21)，显示出极好的重复性。

★ naica^®multiplex PCR MIX应用亮点

☑  实现数字PCR方法多重检测的高度稳定性和高检测灵敏度；

☑  可在naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统的动态范围内同时定量检测6个独立的DNA靶标，均具有良好线性关系；

☑  5X和10X的数字PCR预混液，提高了naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统高阶多重检测能力；

☑  10X PCR MIX比5X PCR MIX降低50％的体积用量，从而增加DNA的加入量。在检测低浓度样品或稀有靶标时，样本加入量的增加可提高检测灵敏度。

表1 naica^®multiplex PCR MIX货号及规格

naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统

法国Stilla Technologies公司naica^®六通道微滴芯片数字PCR系统，源于Crystal微滴芯片式数字PCR技术，自动化微滴生成和扩增，每个样本孔可实现6荧光通道的检测，智能化识别微滴并进行质控，3小时内即可获得至少6个靶标基因的拷贝数浓度。

数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数，因此无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测；此外，由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值的鉴定，因此数字PCR的反应受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。

微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。

DDPCR的原理是在PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

在ddPCR中的微液滴产生中，ddPCR-DG7500油相可以直接和PCR扩增试剂（包含待测的DNA样品）注入到液滴合成芯片中，产生所需要尺寸的乳液滴微球。随后，将获得的乳液滴微球进行PCR扩增。

ddPCR-DG7500油相是一种包含PFPE-PEG混合结构的HFE7500油相溶液，可以直接用于ddPCR中的乳液微球产生，无需再进行二次处理。该油相可以帮助用户节省实验时间，获得良好的实验结果，同时把精力用于目标产物上，不用担心因油相质量不稳定而产生的不良目标产物。

ddPCR-DG7500油相试剂是一种液体状态，提供1mL包装和2mL包装的两种规格。

名称：数字PCR油相7500试剂

型号：ddPCR-DG7500

规格：液体状态，4℃环境保存，体积：1mL，EP管包装，即开即用。