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前言

上期我们进行了免疫荧光原理、实验步骤的探讨，本期我们一起走进免疫荧光常见问题的分析，帮助大家解决在实验过程中遇到的一些问题，让大家都能成为免疫荧光小能手。

常见问题

1背景荧光高

① 洗涤不足——充分洗涤，适当增加洗涤次数和时间；

② 样本干燥——在湿盒中孵育抗体，避免干燥；

③ 抗体浓度过高——预实验测定浓度；

④ 样本自发荧光——染色前先行检测自发荧光情况；

⑤ 封闭不充分——延长封闭时间或更换封闭液；

⑥ 二抗非特异性结合——做一组只加二抗孵育的作为对照；

⑦ 抗体孵育时间过长——严格控制孵育时间，适当减少孵育时间；

⑧ 切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时)——有时切片脱蜡至修复会过夜，第二天加抗体进行染色，如果将装有切片和修复液的容器放在4ºC冰箱过夜，对结果无明显影响，如果放在室温，特别是炎热的夏天，会出现背景着色，因此，不可存放时间太长；

⑨ 荧光背景噪音大——更换荧光显微镜，使用能够降低背景荧光干扰的显微镜。

2荧光信号弱

① 荧光通道的激发波长和发射波长与染料不匹配——确保使用的显微镜的荧光通道与染料荧光基团的波长相匹配；

② 一抗或二抗不兼容——注意种属是否正确；

③ 一抗不好用——阳性对照确认抗体有效性；

④ 固定过度或不充分——适当调整固定时间；

⑤ 样本保存不当导致荧光淬灭——注意保存过程中的湿度和避光；

⑥ 一抗变质或质量差的多克隆抗体——注意抗体有效期，与新买抗体或用过的抗体作比较；

⑦ 信号弱或无信号——可裂解细胞后，用WB验证目标蛋白在细胞中是否表达；

⑧ 显微镜收集荧光和成像的能力差——选择一款相机配置好、荧光收集能力强、成像效果好的荧光显微镜。

3细胞/组织形态被破坏

① 组织从玻片上脱落或有气泡——适当增加固定时间，封片时注意不要产生气泡；

② 细胞或组织固定不充分，自发裂解——使用交联性固定剂，适当增加固定时间；

③ 组织切片撕裂或有褶皱——切片过程导致的问题，考虑重新进行切片。

4定位不对

可使用带明场通道的荧光显微镜进行共定位，如下图：

① 细胞核干扰——细胞核位置前面的细胞质染色干扰造成，可以降低抗体浓度或孵育时间；

② 细胞或者组织状态不对——细胞或者组织状态不同导致目的蛋白细胞定位不同，造成最后的定位不对，可重新培养细胞调整好状态或者重新取材，进行再次染色；

③ 核定位不对——可将封闭和打孔合为一步，即在封闭液中添加0.5% TRITON-100，37℃封闭2h，加一抗后4℃孵育过夜(16h)；

④ 不确定观察到的是不是需要的染色位置——使用带明场通道的荧光显微镜，进行荧光定位，确定观察到的染色位置是否正确。

对照实验设置

1内源性组织背景对照

某些含有固有的生物化学性质的组织或细胞，会产生背景或自发荧光，对结果产生影响。以下图为例，DAPI染核，FITC染边界和中间的晶状结构，而TRITC染整个组织背景的颜色，但绿色也产生了背景荧光，对三通道叠加造成了干扰。

2阴性对照

使用确定不含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性。

3阳性对照

与阴性对照相反，用确定含有待测抗原的细胞或组织，与待测样本统一处理，同一观察，结果若为阳性，可证明待测抗原具有活性且实验过程没有问题，方法操作可靠。

免疫荧光高清成像

在精心完成免疫荧光后，选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：

☑  正倒置一体快速切换——切片、细胞观察随心切换，无惧任何耗材；

☑ DHR数字降噪功能——极大地降低了背景噪音和荧光干扰，提高图像锐度，加深细节，得到分辨率更高的图片；

☑  强大的Z-Stacking功能——通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；

☑  500MP单色相机——能够采集更多荧光信号，助力低荧光强度样本观察；

☑  多通道荧光自动拍摄叠加功能——可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。

前言

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，它是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。

一、实验步骤

免疫荧光实验的主要步骤包括 样片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育、封片及荧光检测等。

1、 样品准备

对于单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过（70%乙醇中浸泡）的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片即可，操作过程要小心，防止细胞脱片。

对于悬浮生长细胞，有两种方式，一种是取对数生长细胞，制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入封闭液中固定，封闭后滴加一抗和二抗孵育；另一种是先在悬浮液中进行固定和染色，离心洗脱后，用移液管移至盒式玻片进行后续抗体孵育。

对于冰冻切片制备，建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。组织一定要冷冻适度，切片时选用干净锋利的刀片，防止裂片和脱片。

对于石蜡切片的制备，要先进行脱蜡和抗原修复的处理。

2、固定

做好切片并风干后立即用合适的固定液（固定液包括有机溶剂和交联剂，其选择取决于抗原的性质及所用抗体的特性）进行固定，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

固定时间则取决于固定组织切片的大小和类型，对大多数组织，18-24h即可，而细胞的固定时间较短。

3、通透

针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透剂进行通透，这一步的目的是使抗体进入胞内。

4、封闭

为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用封闭液（一般包括与二抗同一来源的血清、BSA或者羊血清）封闭，减弱背景着色。封闭开始后，要注意样品的保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育温度一般分为：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2h，4℃过夜（从冰箱拿出后37℃复温45min）。具体条件还要根据样品、稀释液等条件进行摸索尝试。

6、荧光二抗孵育

荧光二抗孵育一般在室温或37℃孵育30min-1h，该过程必须在避光环境下进行，防止荧光淬灭。荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时采用小包装并进行适当的离心。

7、复染

一般采用DAPI进行复染，目的是形成细胞轮廓，从而对目标蛋白进行定位。

8、封片

为了长期保存，我们需要对样本进行封片，用吸水纸吸干爬片上的液体，一般用缓冲甘油等或专门的抗荧光淬灭的封片液。

9、 荧光观察

有条件的话立即用荧光显微镜观察拍照，若不能及时拍照，也要做好封片和封固，保持避光和湿度。荧光显微镜的成像能力对最终的结果也会造成很大的影响，好的荧光显微镜能够最大限度地收集荧光信号，并呈现高分辨率的图片，使细节更清楚，更易得到一张效果极佳的结果图。

注意：

切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染；

(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。可使用浸洗方式；

(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质；

(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。

根据上述步骤完成免疫荧光实验后，就需要进行荧光显微成像，得到我们想要的结果。选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜

Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：

☑ 正倒置一体快速切换：切片、细胞观察随心切换，无惧任何耗材；

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☑ 强大的Z-Stacking功能：通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；

☑ 500MP单色相机：能够采集更多荧光信号，助力低荧光强度样本观察；

☑ 多通道荧光自动拍摄叠加功能：可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。