免疫检查点抑制剂治 疗后流式细胞仪检测方法的建立
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最近一段时间,随着疾病诊疗的精 准化,各个版本新冠诊疗指南的出炉,淋巴细胞亚群、精细亚群和细胞因子等与免疫力监控高度相关的指标受到了高度关注。
在众多的免疫指标中,选择哪些监测指标,如何建立自建方案并验证,如何建立与疾病诊疗相关指标的Cutoff值,这些都是当下流式工作者们开展更多免疫指标时会遇到的一些难题。下面这篇文章对上面提到的几个问题做了详细的解答。
01.背景介绍
免疫检查点抑 制剂治 疗,特别是联合PD-1/CTLA-4 阻断,显著提高了转移性黑色素瘤患者的治 疗率和总生存率 。但同时,与免疫相关的不良反应,如肝炎和结肠炎,是免疫抑 制剂治 疗过程中常见的并发症,其严重的时候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中,巨细胞病毒 (CMV)引起的特异性记忆 T 细胞反应会导致肝损伤,而有研究表明治 疗前血液中 CD4+ 效应记忆 T 细胞 (TEM) 的扩增能够可靠地预测肝炎;所以如果有一种方案可以监测效应记忆T细胞,从而预测不良反应的发生,其将具有很好的临床意义。
本文章作者开发并验证了一个10色流式细胞方案,用于可靠地量化外周血样本中的 CD4+ TEM细胞和其他 irAE 风险的生物标志物。与以前的方案相比,文章作者的新方案在测量CD4+ TEM细胞方面表现出色,并且在从CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T细胞(Naïve T)分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央记忆T细胞 (TCM) 方面表现出色。它还能够精确量化 CD14+单核细胞。
02.实验方案
CD4+ TEM细胞的标记为CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。单核细胞的相同标记为 CD45+CD14+,同时加上将 CD16,以对经典、中间和非经典单核细胞进行更精细的分类。有研究表明将 CD8+ T 细胞中的 CD279 (PD-1) 表达确定为黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 疗后临床反应的标志物 ,因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。为了提高细胞类型定义的准确性,方案中还包括了一个谱系排除 (Lin) 通道(CD19、CD20、CD56 和 CD66b)来排除B 细胞、NK 细胞和粒细胞。因此,新panel包括 10 个参数:CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16,作者将该方案命名为“monocyte and T cell”,简称“MoT”。
该方案用Beckman Coulter的液体试剂进行验证,并在验证完成后,作者将该方案定制成干粉形式,由于干粉产品相比较液体试剂,不仅可室温保存,并且保存时间更久,同时还可以减少实验操作,样本间一致性也更高等优点,便于日常诊断工作并最 大限度地减少差异。
贝克曼库尔特公司不仅可以提供Duraclone干粉成品试剂,还可以提供客户定制CDS,可以根据客户需求,个性化组合定制干粉方案。相比较液体方案来说,定制化的干粉组合方案,不仅有液体单抗方案的自由组合的优点,而且还有干粉试剂的优点。
03.方案圈门策略
该方案用贝克曼库尔特公司的Navios 3激光10色仪器进行数据的采集,并使用Kaluza软件进行分析。
3.1 对CD45+ 白细胞进行圈门;
3.2 对CD3+ T 细胞和CD3- 细胞进行圈门;
3.3 对CD3-内的谱系阴性 (Lin-) 细胞进行圈门;对CD14+ 单核细胞进行圈门;对由 CD14 和 CD16 表达定义的单核细胞亚群进行圈门;
3.4 对CD3+ T 细胞内的CD4+ 和 CD8+ T细胞进行圈门;对CD4+ 记忆T细胞亚群进行圈门;圈门CD279+ CD8+ T细胞。
04.检测性能验证
文章作者将此方案与贝克曼库尔特公司的DURAClone IM T 细胞亚群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了来自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的样本,其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 单核细胞外,其他参数均观察到方法之间的强相关性,CD14+ 单核细胞显示出中等相关性。
DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是贝克曼库尔特公司的Duraclone IM全套抗体组合方案中的第1管与第3管。该产品的优点是干粉,保存的时间比液体更久;而且预混抗体也能节省实验时间,相比于自己混匀抗体后分装染色,样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO 9001认证标准(ISO 9001-2008)。
文章作者之前确立了一个cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子。因此在将患者分类为 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 时,DURAClone IM T 细胞亚群管和 MoT测试管结果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外,E图显示在确定 CMV 血清学状态,并在治 疗开始后 12 周内评估免疫相关肝炎的发展。红色虚线表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值, 中值用黑线表示,MoT 方案在预测 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表现良好。F图显示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正确预测了肝炎。
经过验证,文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子,相关的PPV=83%,NPV=80%。
另外,文章作者还从批内精密度、批间精密度、操作者间分析精度、样本稳定性、样本染色稳定性、年龄、性别和疾病相关偏倚、季节性等方面进行了验证,确保该方案结果是在可接受范围内的,由于篇幅的关系,就不一一列出来了,感兴趣的读者可以去原文查看,其详细的介绍了作者验证思路与结果。
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- 免疫检查点抑制剂治 疗后流式细胞仪检测方法的建立
最近一段时间,随着疾病诊疗的精 准化,各个版本新冠诊疗指南的出炉,淋巴细胞亚群、精细亚群和细胞因子等与免疫力监控高度相关的指标受到了高度关注。
在众多的免疫指标中,选择哪些监测指标,如何建立自建方案并验证,如何建立与疾病诊疗相关指标的Cutoff值,这些都是当下流式工作者们开展更多免疫指标时会遇到的一些难题。下面这篇文章对上面提到的几个问题做了详细的解答。
01.背景介绍
免疫检查点抑 制剂治 疗,特别是联合PD-1/CTLA-4 阻断,显著提高了转移性黑色素瘤患者的治 疗率和总生存率 。但同时,与免疫相关的不良反应,如肝炎和结肠炎,是免疫抑 制剂治 疗过程中常见的并发症,其严重的时候可以危及到生命 。在接受PD-1和CTLA-4的一些晚期黑色素瘤患者中,巨细胞病毒 (CMV)引起的特异性记忆 T 细胞反应会导致肝损伤,而有研究表明治 疗前血液中 CD4+ 效应记忆 T 细胞 (TEM) 的扩增能够可靠地预测肝炎;所以如果有一种方案可以监测效应记忆T细胞,从而预测不良反应的发生,其将具有很好的临床意义。
本文章作者开发并验证了一个10色流式细胞方案,用于可靠地量化外周血样本中的 CD4+ TEM细胞和其他 irAE 风险的生物标志物。与以前的方案相比,文章作者的新方案在测量CD4+ TEM细胞方面表现出色,并且在从CD4+ CD197+ CD45RA+ 幼稚T细胞(Naïve T)分辨CD4+ CD197+ CD45RA- 中 央记忆T细胞 (TCM) 方面表现出色。它还能够精确量化 CD14+单核细胞。
02.实验方案
CD4+ TEM细胞的标记为CD45+ CD3+ CD4+ CD8- CD45RA- CD197- 。单核细胞的相同标记为 CD45+CD14+,同时加上将 CD16,以对经典、中间和非经典单核细胞进行更精细的分类。有研究表明将 CD8+ T 细胞中的 CD279 (PD-1) 表达确定为黑色素瘤患者接受 PD-1/CTLA-4 治 疗后临床反应的标志物 ,因此加上 CD45+ CD3+ CD4- CD8+ CD279+ 。为了提高细胞类型定义的准确性,方案中还包括了一个谱系排除 (Lin) 通道(CD19、CD20、CD56 和 CD66b)来排除B 细胞、NK 细胞和粒细胞。因此,新panel包括 10 个参数:CD45、Lin、CD3、CD4、CD8、CD45RA、CD197 (CCR7)、CD279 (PD-1)、CD14 和 CD16,作者将该方案命名为“monocyte and T cell”,简称“MoT”。
该方案用Beckman Coulter的液体试剂进行验证,并在验证完成后,作者将该方案定制成干粉形式,由于干粉产品相比较液体试剂,不仅可室温保存,并且保存时间更久,同时还可以减少实验操作,样本间一致性也更高等优点,便于日常诊断工作并最 大限度地减少差异。
贝克曼库尔特公司不仅可以提供Duraclone干粉成品试剂,还可以提供客户定制CDS,可以根据客户需求,个性化组合定制干粉方案。相比较液体方案来说,定制化的干粉组合方案,不仅有液体单抗方案的自由组合的优点,而且还有干粉试剂的优点。
03.方案圈门策略
该方案用贝克曼库尔特公司的Navios 3激光10色仪器进行数据的采集,并使用Kaluza软件进行分析。
3.1 对CD45+ 白细胞进行圈门;
3.2 对CD3+ T 细胞和CD3- 细胞进行圈门;
3.3 对CD3-内的谱系阴性 (Lin-) 细胞进行圈门;对CD14+ 单核细胞进行圈门;对由 CD14 和 CD16 表达定义的单核细胞亚群进行圈门;
3.4 对CD3+ T 细胞内的CD4+ 和 CD8+ T细胞进行圈门;对CD4+ 记忆T细胞亚群进行圈门;圈门CD279+ CD8+ T细胞。
04.检测性能验证
文章作者将此方案与贝克曼库尔特公司的DURAClone IM T 细胞亚群管 和 DURAClone IM Basic管平行分析了来自 83 名患有II、III 或 IV期疾病的黑色素瘤患者的样本,其中II 期(n = 52)、III期(n = 11) 或IV期(n = 20)。除CD14+ 单核细胞外,其他参数均观察到方法之间的强相关性,CD14+ 单核细胞显示出中等相关性。
DURAClone IM Basic和DURAClone IM T是贝克曼库尔特公司的Duraclone IM全套抗体组合方案中的第1管与第3管。该产品的优点是干粉,保存的时间比液体更久;而且预混抗体也能节省实验时间,相比于自己混匀抗体后分装染色,样本间的一致性会更高。产品质量满足ISO 9001认证标准(ISO 9001-2008)。
文章作者之前确立了一个cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子。因此在将患者分类为 CD4+ TEM ≥16% 或 CD4+ TEM <16% 时,DURAClone IM T 细胞亚群管和 MoT测试管结果在 81/83 例 (98%) 中一致。此外,E图显示在确定 CMV 血清学状态,并在治 疗开始后 12 周内评估免疫相关肝炎的发展。红色虚线表示 CD4+ TEM ≥ 16% 的cutoff值, 中值用黑线表示,MoT 方案在预测 16 名 IV 期黑色素瘤患者的肝炎方面表现良好。F图显示6 名 CMV IgG+ CD4+ TEM ≥16% 黑色素瘤患者中有 5 名正确预测了肝炎。
经过验证,文章作者用cutoff值≥16% CD4+ TEM 细胞作为 CMV Ig+ 患者检查点阻断相关肝炎的预测因子,相关的PPV=83%,NPV=80%。
另外,文章作者还从批内精密度、批间精密度、操作者间分析精度、样本稳定性、样本染色稳定性、年龄、性别和疾病相关偏倚、季节性等方面进行了验证,确保该方案结果是在可接受范围内的,由于篇幅的关系,就不一一列出来了,感兴趣的读者可以去原文查看,其详细的介绍了作者验证思路与结果。
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- 【病例研究】眼部基因治 疗视网膜下注射
术中光学相干断层扫描(OCT)辅助下Leber先天性黑矇(LCA)黄斑修复术
病例研究的内容
Leber先天性黑矇(LCA)是一组先天性视网膜营养不良,可导致早年出现重度视力损伤。患者通常表现为眼球震颤、瞳孔反应迟钝或近乎缺失、视力严重下降、畏光和高度远视[1]。眼部基因治 疗可极大改善这些患者的视力[2]。通过术中视网膜下注射AAV载体完成基因传递。
视网膜下眼部基因治 疗注射对准确度水平有较高要求。因此,术中光学相干断层扫描(OCT)是一项必不可少的工具。术中OCT可向眼科医生提供实时信息,支持气泡管理,并可用于确认预期的载体量是否到达视网膜下间隙。术中OCT还有助于预防并发症,例如载体注射期间术中形成的黄斑裂孔。
病例研究中值得期待的内容
学习要点
了解21岁视网膜变性及2型Leber先天性黑矇(LCA)患者的手术治 疗
发现视网膜下眼部基因治 疗注射的不同步骤
理解术中OCT在黄斑修复术中的作用
眼部基因治 疗病例描述
1例21岁西班牙裔女性,自出生以来视力不良,包括夜盲症、视野收缩、视力下降和色觉下降。患者注意到出现缓慢的进行性功能性退减。尽管已完成高中学业,但她的方向感日益恶化,并且由于视力限制无法独立生活和工作。
图1:图注:黄斑OCT和超宽视野眼底图像显示基线色素性视网膜病变和相对保留中央凹的感光器改变。图像由A博士提供
诊断与术前评估
双眼术前视力均为20/150。患者表现为典型弥散性视网膜变性,黄斑相对保留。基因检测显示双等位基因RPE65变异导致视网膜变性,并提示2型Leber先天性黑矇。鉴于可获得视网膜活细胞且考虑到眼部基因治 疗的潜在受益,对双眼进行了视网膜下注射治 疗。两次手术之间间隔两周。黄斑OCT和超宽视野眼底图像显示基线色素性视网膜病变和相对保留中央凹的感光器改变。
图2:进行黄斑扫描以记录注射前解剖结构,图像由A博士提供
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术中OCT提高视网膜下基因增强治 疗的手术安全性和治 疗准确性
基因增强治 疗是一种眼部基因转移方法,用于治 疗当功能蛋白不足表现为遗传病时的常染色体隐性或X性染色体连锁视网膜营养不良。这些基因缺陷引发特定视力障碍和/或视网膜变性。
近期,基因治 疗在视网膜营养不良中的应用引发了人们巨大的兴趣。视网膜下基因治 疗药物注射术的技术要求较高,具有一定难度。术中光学相干断层扫描(术中OCT)可提供实时信息并向外科医生提供反馈,包括对眼后段结构的渗透深度、注射液的分布和传播、载体回流以及术中黄斑中心凹的完整性。
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