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细胞琼脂克隆斑形成实验方法1.取MDA-435-OL-Sec23a-GFP和MDA-435-OLLV3NC-GFP对数生长期的细胞制成单细胞悬液,使用血细胞计数板计数后备用。2.使用梯度稀释法适当稀释细胞悬液后,向6孔板的每个孔内分别加入含50个细胞的2mL细胞悬液,细胞悬液使用含10%FBS的DMEM培养液配制。每种细胞均设置3个6孔板复孔。3.12h后镜下可观察到6孔板内细胞已经全部贴壁,此时将皿中培养液换成琼脂浓度为0.2%的含10%FBS的DMEM培养液,置于37°C培养箱内培养。4.10d后镜下可观察到6孔板内出现集落生长的细胞克隆斑。此时弃去含琼脂的培养液,用PBS轻轻润洗2次,然后6孔板内每孔加入2mL冰甲醇固定30min,固定结束后使用PBS轻轻润洗2次,然后使用结晶紫染色5min,再用PBS轻轻润洗后室温干燥。5.干燥完成后将6孔板移至显微镜下观察计数每个孔内细胞克隆斑数量,超过50个细胞的克隆斑即可计数。根据细胞克隆斑形成率=(克隆数/接种细胞数)×1**%来计算细胞体外克隆率。