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用于和DNA或RNA结构类似的寡核苷酸合成的自动化仪器，即是DNA合成仪。通常用于固相合成法，每次在长的寡核苷酸链上接入一个核苷酸。加入每一个核苷酸均通过相同的化学反应和相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。仪器不同，所用化学反应和操作细节也会随之发生变化。DNA合成的磷酸酰胺法得到了非常广泛的应用。

结构和性能

1、辅助真空

隔膜形成一个圆顶小空隙为适当运行阀块的关键。每次打开电磁阀时，在隔膜的螺线管一侧形成辅助真空，使一圆顶空隙形成在隔膜。

2、合成柱

起始在一次性的柱子中装有结合在载体（一般为CPG）上的核苷酸，不仅有柱体，而且还有2个固定过滤板和2个接头，由惰性材料制成所有的部件。

3、流路节流阀

小量的试剂长期在流路节流阀中结晶，会阻塞流路。

4、废液和排气

废气提高排气管往适当的排气装置导入，废液瓶能够在在低于仪器的附近工作台上或者合成仪附近的地板上放置。其是一个空立着的10L的聚苯乙烯容器，为大多数化学试剂输送的终点站。

5、电导池

一空隙隔开的两个电极组成了电导流动池，应用一小电压在空隙之间。其设计是为了对每个DNA合成循环内释放的DMT阳离子的总电导进行测定。

6、电池

DNA合成仪通常带有能够使用几年的锂电池。

7、控制器

软件、微处理机、显示屏幕、键板及相关的电子部件为控制器的主要部分，其对合成仪的所有活动进行指导和初始化。

8、试剂驱动系统

DNA 合成仪通常采用一定压力的惰性气体（氩气）或氮气及电磁阀组；来对液体试剂进行驱动，液体试剂也可以使用氦气来进行驱动。如果slider block滑块系统及精密蠕动泵为合成仪所采用，那么驱动系统也可以不采用气体。当采用气体及电磁阀来对液体试剂进行驱动的时候，首先必须将管路系统电磁阀前段，含试剂瓶组中压力加到规定气压，电磁阀手动或利用合成管理软件打开（通常数ms为打开时间数），就能够将液体试剂驱动所需的合成柱中。

9、试剂和碱基瓶组

碱基瓶组及试剂瓶组通常为DNA合成仪所具备。碱基瓶组通常至少为4个标准碱基（A/C/G/T）,同时和多个特殊碱基瓶位搭配，在荧光标记等合成时使用。试剂瓶组通常至少为6个，包含洗脱乙腈（ACN）、氧化剂（OXI）、盖帽试剂B(capB)、盖帽试剂A（capA)、活化剂（act）和脱保护剂（Deb）。每种仪器通常均会多设置1-2个试剂瓶位，在合成特殊产物时使用。

10、压力管路及输送管路

通常而言，保持内外气体隔绝是DNA 合成仪的原则，所以不管碱基瓶还是试剂瓶都应当密封以便保持一定的压力。特氟龙导管，直径为1/16—1/8吋，是目前为止wei一采用的压力管路。每个瓶子均从瓶盖插塞通入一个输送管道和氩气压力管道。1—8号瓶其压力管道对于亚磷酰胺也作为排气管。输送管需要伸到瓶的底部，氩气管却要在液面以上。当正确设置打开阀门时，氩气对储液瓶上部空间加压，往输送管中推进液体，流到其目的地。

11、亚磷酰胺瓶排气

亚磷酰胺瓶除了加压外，都是用压力排气管排气的，在仪器中放入亚磷酰胺之前，需要将空气用氩气排尽，使其净化。净化是气体通过输送管输送，当瓶内进入气体时，经压力排气管排出空气。废液瓶的出口必须与大气相通。需要使排气管通到通风柜得以确保。如果阻塞排气管，那么会有反压产生，会YZ试剂和溶剂的输送。

12、输送电磁阀

两个试剂阀块(8碱基仪器有3个)及2个或4个柱阀块包含于试剂输送系统中。气体和化学试往柱子及出口流入通过阀块来进行控制。试剂和溶剂（不包括除亚磷酰胺和四唑）均同时往所有活化柱输送。当有多个活化柱时，通过对对流速的细微变化，来对每个柱子的输送次数自动调节来补偿。在废液口、DMT收集口，或DNA收集瓶中通过每一个5—端口柱阀块导入流出物，其也对除去或冲洗柱内和柱阀块内的试剂的氩气进行控制。

与DNA合成仪结构相关文文章：

在体外人对双链DNA分子合成的技术，即是基因合成，不同于寡核苷酸合成：寡核苷酸是单链的，大约100nt为其所可以合成的Z长片段。基因合成却是双链DNA分子合成，50bp-12 kb是可以合成的长度范围。基因合成和其他人工方法合成基因的技术相比，不需要模板，所以基因来源不会对其起限制作用，其为获取基因的方法之一，是使用人工方法合成基因的技术。

 DNA合成流程

接收合成订单

对订单按照实际的情况进行合理的安排，根据加急-测序-内部-外部的顺序依次安排。如果是同一客户，那么将合成尽量安排在同一批次，如大合成量，高G含，链长的部分引物合成比较困难，可能需要推迟一些时间

合成

合成仪的型号不同，合成通量和合成时间都会存在差异。

氨解脱保护

结束合成以后，将载体取出，进行切割并且脱保护，长度通常不超过40bp，且需要2小时以上，链越长需要越长的时间。

纯化

HPLC纯化、脱盐纯化、PAGE纯化以及OPC纯化为目前为止常用且主要的四种纯化方式。

1、脱盐纯化

若有较高的耦合效率，较好的合成效果，短片段不存在粗品中，那么能够直接脱盐。

2、HPLC纯化

HPLC吸附基质包括离子柱和反相柱：

离子柱是按照不同长度的寡核苷酸带有的净电荷不同，洗脱n-片段通过对流动相的离子强度的缓慢增加来进行。

RP(反相柱)是按照疏水性的不同来分离的，在柱内保留的时间，疏水性更强的长片段比短片段更长。

3、OPC纯化

用低浓度的有机溶剂通过OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和力洗脱不带DMT的短片段，用1ml的20%乙腈洗脱用酸除去DMT后的吸附在柱芯里的DNA。

4、PAG纯化

分离的原理是利用在胶中DNA不同片段的迁移率不同，,大片段有着较大的分子，较多的电荷，也就只有较慢的迁移的速度。待等目的片段与N-片段分开后，将目的片段切下，在80摄氏度下孵育2h后脱盐。

与DNA合成仪操作规程相关文文章：
• DNA合成反转录的注意事项和操作步骤
• 人工合成DNA应用和操作步骤
• DNA合成反转录的作用和过程

用于和DNA或RNA结构类似的寡核苷酸合成的自动化仪器，即是DNA合成仪。通常用于固相合成法，每次在长的寡核苷酸链上接入一个核苷酸。加入每一个核苷酸均通过相同的化学反应和相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。仪器不同，所用化学反应和操作细节也会随之发生变化。DNA合成的磷酸酰胺法得到了非常广泛的应用。

特点与性能

根据产物承载容器来分，能够分为两类，分别为无需一次性合成仪两类与一次性合成柱。POLYPLEX, ABI，oligomaker，mermade， ASM等所有品牌合成仪的合成产物的承载容器均使用一次性合成柱（不包括德国polygen系列合成仪）。

根据试剂碱基添加方式分类，电磁阀气动驱动，蠕动泵驱动分别为DNA合成仪的两种类型。

1、采用蠕动泵驱动型

碱基试剂溶液采用精密蠕动泵来进行驱动不同碱基试剂溶液，选择添加通过蠕动泵驱动，相互滑动滑块。德国POLYGEN 系列DNA合成仪为主要的品牌。

2、电磁阀气动驱动型

碱基试剂溶液采用高于大气压的惰性气体（氩气，氮气或氦气）来进行驱动，试剂或碱基溶液的添加通过开合微量电磁阀。mermade系列DNA合成仪、GE系列合成仪、biolytic系列合成仪、oligomaker系列合成仪以及ABI系列合成仪均为DNA合成仪的主要品牌。

根据用途不同，实验室型，工业型和大规模合成为DNA合成仪的三种主要类型。

1、工业型

工业型合成仪主要指单柱合成产物为10-1000nmol且有很大合成通量的DNA合成仪。96柱、192柱为工业型合成仪常见的合成柱数，很少见到384柱或更多合成柱数的合成仪。主要在大型实验室，公用实验平台及商业合成机构适用。金斯特，金维，上海捷瑞，华大基因上海生工，北京赛百盛为国内主要的商业合成机构。

和实验室型品牌相比，有相对比较少的该类型DNA合成仪，在欧洲较常见的工业型合成仪有384柱合成塔和polygen 96柱合成工作站。美国mermade，美国polyplex，丹麦oligomaker，美国biolytic为常见的品牌。

2、大规模合成型

单柱合成产物量能够达到数克，甚至数公斤的合成仪，即是大规模合成型合成仪，主要在原料药制备等科研或商业用途使用，GE health及国产的pilot 500为目前为止可以提供大规模合成仪的厂家。

3、实验室型

主要指单柱合成产物为10-1000nmol且只具有较小的合成通量的DNA合成仪，这类NA合成仪的合成柱数通常不超过48柱，对于化学生物学实验室，或某些刚起步的商业机构来说比较适合使用。

有比较多的该类型DNA合成仪品牌。例如BIOSSET ASM-800， AZCO OLIGO-8；仍然量产的polygen 10柱，12柱，mermade4，6,8,12,48柱；以及已停产的ABI391,394,3400,3900，BECKMAN oligo-1000等。

与DNA合成仪特点相关文文章：

用于和DNA或RNA结构类似的寡核苷酸合成的自动化仪器，即是DNA合成仪。通常用于固相合成法，每次在长的寡核苷酸链上接入一个核苷酸。加入每一个核苷酸均通过相同的化学反应和相应的嘌呤或嘧啶碱基衍生物作用。仪器不同，所用化学反应和操作细节也会随之发生变化。DNA合成的磷酸酰胺法得到了非常广泛的应用。

发展

GX率、高产率的仪器的开发与研究、应用领域的开拓和机器性能的完善为当前DNA合成仪的主要生产厂商的致力方向。

全世界di一台高密度复制DNA合成仪已经为台湾科学委员会“基因医药卫生科技研究计划”中的基因生物技术组成功研发出来，每天能够对768条DNA进行合成，能够同时对384条不同DNA进行合成。并且能够和聚合酶连锁反应装置相配合，对各种基因大量复制，除了对时间进行节省外，还能够对大量人力进行节省。这部机器能够将防伪基因、动物、人体、植物的基因甚都复制出来。

因为目前DNA合成仪可以合成的Z长核酸链的碱基对数量对于人们所需要的大部分核酸的碱基对数量来说还远远不够，所以，还需要对合成工艺不断地进行改善，才能够使较长的核酸分子得到。

不断涌现出按照不同化学方法研制的DNA合成仪，可以将现有核酸合成的碱基对数量限制突破，使大量人力、物力、财力得以节省，以便将来能够对酶的结构进行改变，使其在工业上更有价值。对蛋白质和多肽的结构进行改变，使新药物得以制备，并且对有关人类疾病和遗传调控的新领域进行了开拓。

有效方法

分离和制造目的基因的一些有效方法在基因工程学工作者艰苦细致的探索研究下已经掌握了。通常而言，目前有反向转录法、基因组扩增法、人工合成三种获取目的基因的方法。

1、人工合成

全长引物根据某一蛋白质的基因序列或氨基酸序列，进行设计，模版DNA通过OVERLAP方法来形成，再利用PCR扩增的方法使双链DNA得到，之后在克隆载体或者表达载体中转化克隆PCR产物。目前为止，速度Z快，准确率Z高的方法是化学合成全基因，同时能够以密码子在不同宿主细胞的不同的实验需求和偏爱性，对基因序列进行设计，使表达水平得以提高。

2、反向转录法

对于分子量较大而又不知其序列的基因，反向转录法比较适用，其的模板为目的基因的mRNA，对上下游引物进行设计，对反转录酶合成碱基互补的DNA片段进行借助，然后再在DNA聚合酶的作用下将双链cDNA合成，也就是目的基因的双链DNA。

3、基因组扩增法

基因组能够通过基因组抽提试剂盒直接从细胞、植物、血液、动物组织中分离出来，对特异扩增的引物进行设计，模版利用抽提的基因组，直接通过PCR扩增来对目的基因进行获取。

与DNA合成仪发展相关文文章：

反转录PCR（Reverse Transcription，RT-PCR）又叫做逆转录PCR。将组织或细胞中的总RNA提取出来，模板使用其中的mRNA，利用逆转录酶，采用随机引物或Oligo(dT)反转录成cDNA，模板再使用cDNA进行PCR扩增来对基因表达进行检测，或者使目的基因获得。

介绍

特异性引物

引物使用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸是Z为特异的引发方法。如果两种特异性引物为PCR反应所使用，利用与mRNA 3’端Z靠近的配对引物作为第yi条链的合成的起始。用此类引物只会有所需要的cDNA产生，使得PCR扩增更为特异。

随机六聚体引物

当有可以使反转录酶终止的序列在特定mRNA时，从而使得对其全长序列进行复制很困难，全长mRNA的复制能够通过随机六聚体引物这一不特异的引物来进行。当使用该方法时，全部cDNA第yi链模板由体系中所有RNA分子所充当，在扩增过程中，所需要的特异性赋予给了PCR引物。rRNA一般作为用此引物合成的cDNA的96%的来源。

Oligo(dT)

为一种对mRNA特异的方法。由于3’端Poly(A )尾为绝大多数真核细胞mRNA所具有，当其配对Oligo(dT)的时候，只能够转录mRNA。因为在总RNA中，Poly(A )RNA只有1-4%的比例，所以和随机六聚体作为引物和得到的cDNA相比较，此种引物合成的cDNA得到更少的数量和更为简单。

1、嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在存在Mn2下，高温反转录RNA被允许，用来对RNA模板的二级结构进行消除。

2、MMLV反转录酶的RNase H-突变体：

和其它酶相比较，更大部分的RNA能够由此种酶被转换成cDNA，这一特性为从不易低温反转录、含二级结构的mRNA模板使较长cDNA合成所允许。

3、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

37℃是Z合适的作用温度，有着相对比较弱的RNA酶H活性，聚合酶活性比较强。

4、 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

42℃是Z合适的作用温度，RNA酶H活性和聚合酶活性都比较强。

应用

RNA检测的灵敏性由于RT-PCR提高了几个数量级，提供了一些可能性对于分析一些极为微量RNA样品。RNAGX转录系统的构建、cDNA探针的合成、目的基因的获取以及基因的转录产物的分析为该技术的应用

RT- PCR即逆转录PCR，是结合了cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）和RNA的逆转录（RT）的技术。RT-PCR技术有着广泛的用途并且非常的灵敏。能够被用来对特定基因的cDNA序列直接克隆以及对细胞中RNA病毒的含量和细胞/组织中基因表达水平进行检测等。

与DNA合成原理相关文文章：
• 人工合成DNA的概念和原理
• 全基因合成介绍
• 基因合成优点和应用

反转录是指在基因工程进行过程中，将RNA作为模板，将DNA遗传信息提取出来的过程。对于DNA生物合成而言，反转录是一种特殊的方式。将RNA作为模板，利用反转录酶，合成DNA的过程，即是反转录。

反转录酶活性

多种酶活性为大多数反转录酶所具有，分别为下述几种活性。

1、DNA聚合酶活性

利用RNA作为模板，对dNTP进行催化使DNA合成的过程。需要将RNA作为此酶为引物。色氨酸的tRNA占多数，DNA以5′→3′方向在引物tRNA3′－末端合成。反转录酶催化合成的DNA有比较高的出错率，因为3′→5′外切酶活性不为反转录酶所具备，即是校正功能其不具备。

2、RNase H活性

RNase H从RNA5′端将通过反转录酶催化合成的cDNA与模板RNA形成的杂交分子的RNA分子水解掉。

3、DNA指导的DNA聚合酶活性

底物使用dNTP，模板使用反转录合成的第yi条DNA单链，再次将第二条DNA分子合成。

4、其他

另外，DNA内切酶活性还存在于某些反转录酶中，这也许和在宿主细胞染色体DNA中整合病毒基因相关联。

介绍

反转录酶，又叫做依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），其在反转录过程中起催化作用，就是利用RNA作为模板为DNA链的合成进行催化。

合成的DNA链叫做与RNA互补DNA（cDNA）。在一些RNA病毒中存在反转录酶，病毒的恶性转化可能与其相关。人类免疫缺陷病毒（HIV）亦是一种RNA病毒，反转录酶亦包含其中。反转录酶亦存在于小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中。推测细胞分化和胚胎发育可能与其相关。

作用

反转录酶的发现大大推动了遗传工程技术的发展，到目前为止，其作为一种工具酶，起到非常重要的作用。mRNA通过组织细胞被提取，并且将其作为模板，在反转录酶的作用下，将互补的DNA(cDNA)合成出来，通过这将cDNA文库(cDNA library)构建出来，从中将特异的目的基因筛选出来，使目的基因在基因工程技术中获得，其为Z常用的方法。

与DNA合成方法相关文文章：
• DNA合成方法

在体外人对双链DNA分子合成的技术，即是基因合成，不同于寡核苷酸合成：寡核苷酸是单链的，大约100nt为其所可以合成的Z长片段。基因合成却是双链DNA分子合成，50bp-12 kb是可以合成的长度范围。

DNA合成常见问题

怎样按照使用浓度溶解引物?

 记住几个参数:

1OD引物干粉约为33微克;

碱基的平均分子量为324.5;

引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量;

引物的摩尔数=质量数/引物分子量

真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部,开启瓶盖时小心不要丢失;请加入足量的水充分振荡溶解。

如何保存引物?

我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来,无菌,无核酸酶。可以室温或-20C密闭长期保存;溶解以后的DNAZ好保存在-200C,溶解引物的水的PH要求大于7,并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。

已经溶解的引物,为什么原先使用正常,而过一段时间再使用就不好了?

如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶,会使引物降解。不少实验室用的双蒸水PH<6,使用时没有充分解冻振荡混合,液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。

如何测定引物的OD值?

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用,测定时溶液的光密度Z好稀释到0.2-0.8之间DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后,取部分溶液稀释到1ml并在1m标准比色杯中测定其光密度,即为所测体积的OD值,进而可以计算出母液的OD值。

如何检测引物的纯度?

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性。加入尿素的目的一是变性二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。(有时由于变性不充分,主带之上可能会有条带,乃是引物二级结构条带。)

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