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DNA合成反转录的注意事项和操作步骤

类型：DNA合成仪操作规程 2019-09-20 17:21:02 1450阅读次数

反转录PCR又叫做逆转录PCR。将组织或细胞中的总RNA提取出来，模板使用其中的mRNA，利用逆转录酶，采用随机引物或Oligo(dT)反转录成cDNA，模板再使用cDNA进行PCR扩增来对基因表达进行检测，或者使目的基因获得。

注意事项

1、实验过程中，需要使RNA的完整性保持，避免RNA降解。在提取总RNA过程中，放置mRNA断裂特别需要注意。

2、设阴性对照以便避免非特异性扩增。

3、为了对靶RNA进行定量，而设定内参。β-Actin（β-肌动蛋白）、G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）等为比较常用的内参。使各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差、加样误差以及RNA定量误差得以避免为其目的。

4、目标DNA起始的数量和所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构均有可能导致PCR出现平台效应，进入平台期。所以应当通过单独实验来确定所有目标序列出现平台效应的循环数。

5、避免DNA的污染。

在可能的情况下，在基因的不同外显子内放入PCR引物，来对基因和mRNA的共线性进行消除；RNA样品采用DNA酶来进行处理。

操作步骤

a、提取总RNA。

b、合成cDNA第yi链。

1、将1-5μg总RNA加入到0.5ml微量离心管中，将适量的DEPC H2O加入，使溶液总体积为11μl，将10μM Oligo（dT）12-18 1μl加入到管中，轻轻混合均匀，离心。

2、在温度70摄氏度下加热10分钟，马上往冰浴中插入微量离心管，至少保存1分钟。之后将0.1M DTT 2μl，10mM dNTPmix 1μl，25mM MgCl2 2μl，10×PCR buffer 2μl的混合试剂加入，轻轻混合均匀，离心，在42摄氏度下孵育2-5分钟。

3、将1μl SuperscriptⅡ加入，在42摄氏度水浴中孵育50分钟。

4、在70摄氏度下加热15分钟以后使反应终止。

5、在冰中插入管，将1μlRNase H加入，在37摄氏度下孵育20分钟，对残留的RNA进行降解，保存在零下20摄氏度下备用。

c、PCR

1、将0.5ml PCR管取出，将第yi链cDNA 2μl，上游引物（10pM） 2μl，下游引物（10pM） 2μl，dNTP(2mM) 4μl，10×PCR buffer 5μl，Taq 酶（2u/μl） 1μl这些试剂依次加入。

2、将适量的ddH2O 加入，使总体积为50μl，轻轻混合均匀，离心。

3、对PCR程序进行设定。28-32个循环在适当的温度参数下扩增。将一对内参的特异性引物在PCR扩增目的基因时加入同时对内参DNA进行扩增，作为对照，以使实验结果的可靠与准确得以确保。

4、进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下对结果进行观察。

5、电泳条带采用凝胶图像分析系统进行密度扫描

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