PCR新手指南:各种热启动酶存在的意义
各种热启动酶存在的意义
市场上热启动的酶种类很多,但新手并不完全了解热启动酶存在的意义。
非热启动的Taq酶在较低温度时也有活性:我有一本1992年出版的《PCR基因扩增实验操作手册》中提到,酶在70度时的合成速度为60核苷/秒/酶分子,55度时为22,37度时为1.5,22度时为0.25。也就是说此时引物还没有正常配对(其可能错误配对),而酶已经开始合成了,其合成的产物就会成为以后扩增中的非特异模板。
则热启动酶只有在95度高温一段时间后,其酶活动才启动起来,故名:热启动酶。
这也是为什么进行PCR反应加样时,各种试剂要在低温下加样。但是不是在进行PCR反应加样时维持低温就不需要热启动酶了呢?答案是也不尽然。
一般PCR仪在运行开始后热盖加热过程中,模板温度是不控制的。由于热盖的加热需要1.5分钟以上,且热盖温度一般设在105度,必然会引起模块温度的上升,一般会到30-35度,环境温度高时更甚。也就是说设计不完备的仪器也会提高非特异性反应。
有些仪器的热盖在开机时就启动,这样做有可以广场烫手且用户开机后立即启动PCR程序也会造成非特异性反应。东胜龙811PCR仪的解决办法是在运行开始后热盖加热过程中迅速将模块降温到10度左右。热盖温度到达后启动程序运行。
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