西尼罗河热病原血清学检测技术

（1）间接免疫荧光抗体试验该方法用于检测抗体，但一般不被采用，只在那些没有建立起ELISA方法的实验室使用。首先将待检血清进行1：32的稀释，把稀释好的血清加到包被WNV抗原的玻片上，并设阴性对照，4℃过夜或37~C孵育30min，洗涤，再加上荧光标记的IgM或IgG的抗体，30rain后在荧光显微镜下观察结果。

（2）蚀斑减少中和试验该方法用于检测病毒抗体，可对两种抗原性相关的病毒的感染进行鉴别。采用病毒中和试验进行鉴别时，其判定标准是：双份血清样品（急性期和康复期）的中和效价有4倍或更大的差异。该技术有较高的灵敏度和特异性，但操作过程烦琐，难以应用于大规模普查。
WNV典型的毒株为NY99株，该毒株能引起Vero细胞产生细胞病变，而用琼脂覆盖后形成病毒蚀斑。检测马血清样品时首先将待检血清做1：10和1：100稀释，用稀释好的血清与标定的PFU为100的NY99株WNV混合，在37℃孵育75rain，再将混合物接种到总面积25cm2长满单层Vero细胞的培养瓶内，孵育60min后覆以琼脂，继续培养72h，用含中性红的琼脂覆盖1次，第2天观察记录蚀斑形成情况。若病毒蚀斑减少90％可判为阳性。

（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）该技术是目前用于西尼罗河病毒抗体检测的主要方法，在许多情况下代替了血凝YZ试验、补体结合试验和中和试验。Z常用的是IgM捕捉ELISA（MAC-ELISA）方法，此法操作要求较低，具有广泛的应用前景。血清学检测结果表明，该病毒的IgM可持续好几个月，但只有在急性发病阶段或渐愈病人（至少发病后10天收集）才容易检测出来。对有WNV脑炎的病人而言，高水平的抗体水平意味着感染了病毒。仅从血清中检出该病毒的抗体，虽支持了临床诊断，却不足以确诊。用全病毒抗原进行抗体检测时，黄病毒成员之间会发生血清学交叉反应。

2001年，美国农业部有关实验室在原有的东方马脑脊髓炎IgM抗体捕捉ELISA方法的基础上经过改进，利用新生乳鼠脑组织制备的WNV灭活抗原，建立了检测WNV的IgM抗体捕捉ELISA方法。该方法是现有检测血清和脑脊液中病毒抗体Z敏感的筛检方法，一般在马感染后数天即可检测到IgM抗体，持续时间Z长可达2个月。检测时首先将待检的马血清做1：100和1：1000稀释，脑脊液做1：2和l；20稀释。用抗IgM抗体包被微量反应板，用50ml／L脱脂乳封闭，然后加稀释的马血清或脑脊液，4℃过夜，洗涤，分别加病毒抗原、阴性对照抗原，洗涤后加酶标记的病毒抗体，Z后加底物，测OD值。病毒抗原孔的OD值超出阴性对照孔OD：10值的2倍者，判为阳性。

近年，国外有人利用基因重组技术表达了WNV的PrM／E蛋白，将重组蛋白作为IgM捕捉ELISA的抗原，并通过实验证明了重组蛋白作为检测抗原的可行性。W．C．DavidBea-sley等利用表达的重组E蛋白结构域Ⅲ作为检测WNV血清抗体的间接ELISA的抗原，并实验证明了该重组蛋白可作为WNV与日本脑炎病毒血清群的其他病毒感染的血清鉴别检测的抗原。这种方法既安全又可进行鉴别诊断，具有较好的应用前景。

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