凝胶电聚焦测定蛋白质等电点的操作方法

凝胶电聚焦按形状分为垂直柱状和垂直板状两种，他们的操作基本上分别与普通垂直柱状和板状的凝胶电泳相似。下面以垂直柱状电聚焦测定蛋白质等电点操作为例，进行简要叙述。
加样品
一般加样品量约为25／A1，比较稀的蛋白质样品液可直接加在聚丙烯酰胺凝胶溶液中，也可把样品溶解在10mol／L尿素中（使用变性凝胶系统时），加在凝胶柱顶部，而后在样品液上覆盖一层1％两性电解质载体，以防酸性或碱性电极溶液破坏蛋白质。
聚焦
聚焦时所用的电极液要根据两性电解质载体的pH值范围而定。随后接通电源，使电压恒定在200V／6cm胶柱。聚焦6～8h，即直接电流恒定在约lmA／管时停止聚焦。
固定与染色
用一般方法从电聚焦完成的玻管中取出胶柱，按下列方法进行固定和染色。
1．氨基黑染色法将胶柱浸入10％三中，每隔2h换1次，共换约10次（若用旋转法连续不断更新此液固定时间可缩短）。随后把胶柱转移到含0．5％氨基黑的14％乙酸溶液染色，用5％乙酸溶液脱色，此法优点是灵敏度高，缺点是耗时长。
2．考马斯亮蓝染色法将胶柱浸在12．5％三溶液（4℃）中连续转动，除去胶中的两性电解质后，浸入预热至65℃0．1％考马斯亮蓝固定染色液[考马斯亮蓝R2s。1g，溶于1L三混和液（三150g，磺基水杨酸45g，甲醇375ml，加蒸馏水930m1）]中30min左右，而后用酸性乙醇溶液（乙醇：蒸馏水：冰乙酸＝25；25：8）脱色。此法既快又灵敏。
样品pH值的测定
聚焦完毕，胶柱两端和玻管外壁用蒸馏水洗涤3次，以免沾有电极液而影响真实pH值。随后从玻管中取出胶柱，-70℃冰冻lh，用切片机切成lmm厚的薄片。把两个或两个以上凝胶柱相同位置的薄片，按次序分别浸入0．5mlKCl0．0／mol／L溶液中，摇动几分钟，依次用微量电极测定其相应pH值。此外，也可将洗涤过的胶柱用刀片按0．5cm长度分段切下，按次序分别浸入4ml0．1mol／LKCl溶液中，在4℃环境下过夜。移至室温平衡后，测出各段的pH值，以各段胶所在位置，即距离为横坐标，以相对应浸泡液pH值为纵坐标作图，便可绘出胶柱上的pH梯度曲线。
蛋白质的洗脱
用适当方法把凝胶柱切成薄片，然后把各薄片分别放在含有一定量12．5％三溶液的5ml玻璃匀浆管中匀浆，离心后，凝胶块分别用50X乙醇、无水乙醇和洗涤，用0．1mol／L甲酸溶液抽提3次，收集甲酸溶液冻干，再溶解即可测定其蛋白质含量。
等电点的测定
20世纪80年代初建立的固相pH值梯度电聚焦法（1PGIEF）是一种分辨率很高的pI测定方法。其固相pH梯度凝胶是由一系列弱碱性和弱酸性的丙烯酰胺衍生物与丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂作用下形成的。用此衍生物制备固相pH梯度凝胶的过程是，将所需的该物质分别加入盛聚丙烯酰胺的混合瓶和储存瓶中，经适当调节就能形成固相pH梯度凝胶。而它的pH梯度范围则是由酸性和碱性丙烯酰胺衍生物的比例和pK值等因素决定的。
根据胶柱上的染色位置（经校正后），或洗脱液含有蛋白质的凝胶位置，与pH值的曲线图相对比，即可测出蛋白质的等电点。
另外，用标准蛋白质的等电点（纵坐标）对其在电聚焦中移动的距离（横坐标）作图，即可得到标准的等电点曲线图。当测定未知样品的等电点时，只要在同样的电聚焦条件下求出其移动的距离，就可以从等电点曲线中查出相应的等电点。
这种方法测定等电点的不足之处是，有些蛋白质能与两性电解质载体发生可逆性结合，形成虚假的多重区带，故用它鉴定蛋白质纯度时必须注意。在电聚焦时，改变加样品部位，或改变凝胶中两性电解质的浓度，电泳图谱不会发生改变。另外，电聚焦形成的单一区带再进行电聚焦，其仍然为单一区带时，则表明两性电解质载体和待测样品组分并不互相作用。经过这些检测后，得出的等电点结果是可靠的。

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