绿色荧光蛋白GFP的应用

　　绿色荧光蛋白GFP的应用

　　绿色荧光蛋白GFP的应用主要集中在利用其荧光性质的基础上作为一种标记物。

　　1 绿色荧光蛋白GFP在分子生物学上的应用

　　1.1 绿色荧光蛋白GFP作为报告基因

　　报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的DNA，如传统的荧光素酶(LUX)基因和β-葡萄糖苷酶(GUS)基因。绿色荧光蛋白GFP作为基因报告可用来检测转基因效率，把绿色荧光蛋白GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。目前，此方法无论在农杆菌介导或基因枪介导的植物遗传转化中还是在活细胞、转基因胚胎和动物中都已得到非常广泛的应用，特别是在活细胞基因表达的时空成像方面。

　　1.2 绿色荧光蛋白GFP作为融合标签

　　绿色荧光蛋白GFP*成功的一类应用就是把绿色荧光蛋白GFP作为标签融合到主体蛋白中来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。在多数情况下，绿色荧光蛋白GFP基因在N-或C-末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可以检测蛋白质分子的定位、迁移，还可以研究蛋白质分子的相互作用以及蛋白质构象变化，并依靠荧光共振能量转移即FRET来进行检测。

　　2 作为生物传感器

　　2.1 检测pH

　　野生型GFP和其许多突变体都具有依赖于pH的荧光变化，因而可以被用来检测活细胞内的pH。人们通常称它们为Phluprin。分为两类：比率Phluorin和盈缺Phluorin。当pH降低时，比率Phluorin的*大激发波长从395nm到475nm迁移，利用两个***长处的荧光强度的比率可以测量pH;当pH值小于6时，盈缺Phluorin在475nm处没有荧光。当pH回复到中性时，两类Phluorin都会在20ms内复原。

　　2.2 检测卤素离子

　　YFP(H148Q)变体不但对pH敏感而且对不同离子也同样敏感，故可以用来检测亚细胞结构中卤素离子的浓度和传递

　　2.3 其他检测应用

　　另外，GFP可以应用于检测电位、氧化还原水平以及在信号转导中作为Ca2+指示剂

　　3 绿色荧光蛋白GFP在细胞生物学上的应用

　　绿色荧光蛋白GFP具有同宿主蛋白构成融合子的性质，利用这一性质，可以将GFP定位到特定的细胞器和膜系统中，进行细胞生理过程、细胞动力学等的实时观测，或直接应用于定量分析。目前，GFP已经被成功地用于靶向标记包括细胞核、线粒体、质体、内质网等在内的细胞器。用GFP进行亚细胞定位，避免了提纯蛋白、标记异硫氰酸荧光素等荧光染料、经显微注射或其他方式导入细胞的复杂方法，从而使研究蛋白在活细胞的准确定位变得简单易行。

　　4 绿色荧光蛋白GFP在筛选方面的应用

　　4.1 绿色荧光蛋白GFP用于细胞的筛选

　　基于GFP的荧光特性，并且荧光稳定以及检测方法快速、方便，GFP在细胞筛选上得到应用广泛。

　　4.2 绿色荧光蛋白GFP用于药物的筛选

　　利用GFP对目的物进行标记，追踪GFP，分析目的物在细胞中的变化情况，如酶分子分布状态、生物活性、受体、离子通道等变化，从而筛选出与体内信号分子功能相似的化合物