牛奶中蛋白质的测定原理及其注意事项

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【导读】摘要：本文主要针对应用凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的原理及其具体的消化和蒸馏过程中...

摘要：本文主要针对应用凯氏定氮法测定牛奶中蛋白质的原理及其具体的消化和蒸馏过程中分别应注意的几大问题加以介绍，以期对从事蛋白质测定工作的检测人员有一定的帮助。关键词：牛奶蛋白质测定原理注意事项蛋白质对于人体具有构成体内原生质和修补身体组织，并制造酶和激素等生命基础物质，调节生理机能的作用。蛋白质及其分解产物对食品的色、香、味和产品质量都有一定的影响。蛋白质的高低将直接决定食品的营养价值。牛奶作为人体Z佳的蛋白质供给源，属于完全蛋白质，其中的8种人体必需氨基酸种类齐全，比例适当。其蛋白质含量达牛乳的3.4%左右，乳蛋白的消化吸收率一般为97%-98%，高于植物蛋白，而且消化速度又比肉、鱼、蛋等动物性蛋白快。测定蛋白质的方法很多，目前Z基本和Z常用的方法是先测定总氮量，再乘以不同食品的蛋白质系数，即为食品中蛋白质的含量。测定总氮量的方法目前国家标准仍采用凯氏定氮法为法定的标准检验方法。凯氏定氮法有常量法、半微量法和微量法等。其测定原理相同，主要区别在于常量法的样品及试剂用量较微量法多。而微量法则具有实验规模小，实 0引言验费用低的优点。但微量法的准确度和精密度比常量法要差一些。另外，还有双缩脲法、紫外吸收光谱法、福林-酚试剂法、考马斯亮蓝染色法等，也常用于蛋白质含量的测定，由于方法简单快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来国外还推出了近红外品质测试仪对蛋白质进行快速分析的方法。但凯氏定氮法正由于它的诸多优点而仍然应用普遍。 1．测定原理　将含有蛋白质的待测样品同浓硫酸一起加热消化，使氮变成氨，同时形成氨盐，在消化液中加入过量的碱,再加热将氨蒸馏出来,并收集于硼酸溶液中，Z后用酸碱滴定法测定其总氮量。 1.1消化样品中含氮有机物与浓硫酸和催化剂一起加热消化.使蛋白质分解,分解的胺基氨与过量的硫酸结合生成硫酸胺留在溶液中，其主要反应式为： RCH.NH2COOH+H2SO4->CO2+SO2+NH3+H2O2NH3+H2SO4->（NH4）2SO4 　另外，催化剂硫酸铜在有机物全部消化后，溶液显清澈透明的蓝绿色，可用它来指示消化终点。此外，硫酸铜还可用做下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。过氧化氢，为氧化剂，有助于有机物消化，同时可以消除消化过程中的气泡现象。 1.2蒸馏　消化终了后所有蛋白质的氨态氮都转化成铵盐形式，硫酸铵在碱性条件下进行蒸馏，将释放出来的氨用硼酸溶液吸收，生成四硼酸氢铵．其反应式：　　（NH4）2SO4+2NaOH->Na2SO4+2NH3+2H2O NH3+4H3BO3->NH4HB4O7+5H2O 1.3滴定　　用盐酸标准溶液直接滴定产生的四硼酸氢铵，根据消耗盐酸溶液的量计算样品含氮量，然后换算成蛋白质含量。　　NH4HB4O7+HCL+5H2O->NH4CL+4H3BO3 2.试剂与仪器 2.1仪器及用具凯氏烧瓶（500ml）容量瓶（100ml）锥形瓶酸式滴定管（25ml或50ml）上海沛欧SKD-08S2消化炉上海沛欧 SKD-100,200,600定氮仪（或定氮蒸馏装置）2.2试剂试剂要求均为分析纯，所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制浓硫酸凯氏定氮催化剂过氧化氢溶液（体积分数为30%） NaOH溶液：（C（NaOH）=400g/L称取400gNaOH固体，用100ml除去CO2的蒸馏水溶解，待冷却后移入试剂瓶内）硼酸溶液：（C（H3BO3）为40g/L.称取20g固体硼酸，溶解于500ml热蒸馏水中，摇匀备用）　甲基红－溴甲酚绿混合指示剂：　（用体积分数为95%乙醇，将溴甲酚绿与甲基红分别以2g/L溶于95%乙醇溶液中，使用时按5：1的比例混合）　盐酸标准溶液：（C（HCL）=0.1000mol/L） 3.操作过程的注意事项 3.1 消化 3.1.1凯氏定氮法的误差，主要因消化操作的条件而产生，因此要格外注意。　4。结束语　3.1.2量取的样品倒入凯氏烧瓶时，不要将样品粘在瓶颈上，以免加入消化液后试样炭化粘在瓶颈上消化不彻底．消化过程中要逐渐升温，当低温加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升温使溶液沸腾，但应避免剧烈沸腾。　3.1.3消化过程中，消化液体积不可蒸至少于原来的三分之二，更不可蒸干，若硫酸损失过多，应酌量补加硫酸。若取样量较大，如干待测样超过5克，可按每克试样5毫升的比例增加硫酸用量。　　 3.1.4当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%双氧水2-3毫升后再继续加热消化。但在消化后期不得加入，因此消化液中还原物质（如：碳）含量减少，氧化剂易造成氨进一步氧化为氮逸出，使测定结果偏低。 3.1.5消化液澄清后，必须继续加热沸腾三十分钟，以提高氮的回收率，若催化剂中有硒存在，加热时间过长也可能使氮素损失。一般情况下，纯牛奶需消化4.5小时即可。3.2蒸馏　3.2.1．消化液加蒸馏水稀释后，应及时蒸馏，否则应保存消化液，临用时再加蒸馏水稀释．反应室加入碱液后，应立即盖塞并加水封，注意各接头处的密封情况，防止漏气。 3.2.2甲基红-溴甲酚绿混合指示剂必须于临用前按比例混匀，其在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。　3.2.3．蒸馏时，加入的氢氧化钠溶液除与硫酸铵作用外，还与消化液中的硫酸和硫酸铜作用．反应式： 2NaOH+H2SO4->Na2SO4+2H2O 2NaOH+CuSO4->Na2SO4+Cu（OH）2 Cu（OH）2->CuO+Cu（OH）2若加入的氢氧化钠不够，则溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀．所以，加入的氢氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。　3.2.4．蒸气发生瓶内的水装至三分之二体积并且保持酸性（在蒸气发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。　3.2.5．因蒸馏时反应至外层的气压大于反应室内的压力，而反应室的压力大于大气压力，故可将氨带出。所以，蒸馏时，蒸气要发生均匀，充足，蒸馏中不得停火断气，否则，会发生倒吸。停止蒸馏时，由于反应室外层的压力突然降低，可使液体倒吸入反应室外层，所以，操作时，应先将冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分钟后关掉热源。蒸馏是否完全，可用精密ＰＨ试纸测冷凝管口的冷凝液来测定，中性则说明已蒸馏完全。 3.2.6在盐酸标准溶液的配制时，必须将基准无水碳酸钠于270-300℃灼烧至恒重后称取所须用量，否则也会影响蛋白质测定结果的准确性。牛乳提供了人体必需的优质蛋白质，而提供准确可靠的蛋白质含量则是食品检验工作人员的必需技术，凯氏定氮法作为目前法定的国标方法与我们的工作密不可分，本文主要通过综述凯氏定氮法操作的注意事项而提供给关注此检测方法的从业人员一定的帮助，与笔者和读者会有一定提高。

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2004-08-02 09:17:05

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